五味子酮对β淀粉样蛋白诱导大鼠海马神经元内游离钙离子浓度变化的影响.pdf
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1、 7 9 0 ) 产义 , d目分 . 丁匕 军穿. 五味子酮对R 淀粉样蛋白 诱导大鼠 海马 神经元内游离钙离子浓度变化的影响 朱嘉琦拓西平贾丽艳周俊 【 摘要】 目的 观察中药五味子酮对牙 淀粉样蛋白( A 队- 3 5 ) 诱导的大鼠海马神经元内游离钙离子浓度 ( C a “ I i ) 变化的影响。方法采用大鼠海马神经元原代培养技术, 运用双激发波荧光指示剂 F u r a - 2 / A M标记 胞内 相 对 C a - 的变化并进行比 较。 结果 I tL m o l / L A p 2 5 - 3 5 作用于海马神经元4 8 b 后, C a 2 + 为0 . 5 9 5 1 士
2、 0 . 0 3 1 1 , 明显高于空白 对照组的0 . 3 6 1 7 士0 . 0 1 9 7 ( P 9 5 %) , 新生2 4 h 内S D大鼠( 第二军医大学试 验动物中心提供) , A R 2 5 - 3 5 . F u r a - 2 / A M, P l u r o n - i c F - 1 2 7 ( S i g m a 公司) , 马血清、 胎牛血清、 胰蛋白 酶、 D ME M高糖培养基、 B 2 7 无血清培养液、 多聚- L 一 赖氨酸( G i b c o公司) , 阿糖胞昔( 法玛西亚公 7 9 1 ,.n曰nU 5摊任卜j 司) , 解剖液、 K r e
3、b s - H E P E S液( 实验室自制) , C O z 培养箱( S h e l d o n - 2 3 0 0 型, 美国) , 净化工作台( S W- C J - I F型, 苏州安泰空气技术有限公司) , I X 7 0 倒置 相差荧光显微镜、 氛灯( O l y m p u s公司, 日本) , L a mb d a 1 0滤光片 自动转换设备、 C C D相机、 Me t a m o r p h 及 Me t a f l o u r 数码分析软件( U n i v e r s a l I m a g i n g C o r p o r a t io n , 英国) , 计算
4、机( 国 产联想) 。 二、 方法 ( 一) 新生 S D大鼠海马神经元的原代培养 新生2 4 h 内S D大鼠以7 5 %乙醇消毒, 无菌条件 下断头、 取脑, 分离得到海马部位, 用显微手术器械 在解剖镜下剥去脑膜和血管, 以 0 解剖液湿润, 剪碎成 1 m m “的组织块, 加人 0 . 1 2 5 %的胰酶 2 m l , 置于3 7 0C, 5 % C O z 孵育箱消化 3 0 m i n , 加人 完全培养液( 含 1 0 0 g / L马血清和1 0 0 g / L胎牛血 清的D ME M培养液) 终止消化, 将消化后的组织转 入离心管中, 以1 0 0 0 r / m i
5、n ( 离心半径 5 0 c m) 离心 5 m i n 后, 弃上清液, 加人完全培养液 2 m l , 用细口径 玻璃吸管轻轻吹打均匀, 用2 0 0目不锈钢筛网过滤, 去除大块组织块, 调整细胞悬液密度为1 X 1 0 6 / m l , 以1 m l / 皿接种于预先涂有 。 . I %多聚赖氨酸的直 径为3 . 5 c m的培养皿中, 将其置于3 7 0C , 5 % C O , 孵箱中。2 4 h细胞贴壁后, 去除完全培养液, 换用 B 2 7 无血清培养液 2 m l , 以后每 2 -3 天用 B 2 7 无 血清培养液半量换液, 并加人终浓度为5 ti m o l / L 的
6、阿糖胞昔, 以抑制胶质细胞的增殖。 ( 二) 细胞分组及处理 将A 海- 3 。 溶解于B 2 7 培养液, 以5 0 c m o l / L的浓度置于3 7 C , 5 % C O Z 孵箱中“ 老化” 3 d 备用。将培养至第7 天的细胞随 机分为A , B , C 3 组, A组加人终浓度为1 u m o l / L 的A R 2 5 - 3 5 ; B 组加人终浓度为1 p .m o l / L的A R 2 5 - 3 5 和1 0 0 t m o l / L五味子酮; C组加人等量培养液。 继续培养 4 8 h至第 9 天, 在光学显微镜下观察细 胞生长良好, 待测。 ( 三) 细胞
7、内 C a 、 测定的原理和方法原 理: 采用标记示踪法, 即用荧光探针标记靶细胞。 常用的荧光探针有 q u i n - 2 / A M, F u r a - 2 / A M 及 I n d o - I 等, 以后两种较为敏感。F u r a - 2 是一种极性 较强的酸性化合物, 因细胞膜上的磷酸基团也带负 电荷, 故F u r a - 2 不易进人细胞内。F u r a - 2 / A M是 在 F u r a - 2上连接乙酞氟甲醋基, 从而增加其脂溶 性。F u r a - 2 / A M进人细胞后, 在胞浆中的醋酶作 用下, 其醋性基团被水解, 还原为F u r a - 2 o F
8、 u r a - 2 不易透 出细胞膜, 故 留在细胞 内与胞浆 中的 C a “ l i 结合, 并在光源激发下产生荧光, 指示细 胞内钙浓度。F u r a - 2是一种双激发波指示剂, 在 双波长紫外光( 3 4 0 n m / 3 8 0 n m) 激发下, 于 5 0 5 n m产生荧光, 并以 3 4 0 / 3 8 0 信号比值指示细胞内 钙离子浓度。方法: 在显微镜下选取生长良好的神 经元, 吸去培养液, 用温浴的K r e b s - H E P E S 溶液 轻 轻冲 洗3 次, 加人K r e b s - H E P E S 1 m l , p l u r o - n i
9、 c F - 1 2 7 1 0 Ft l 和F u r a - 2 / A M 3 p 1 , 终 浓 度 分 别 为 0 . 0 4 % 和4 t .m o l / L , 置于3 7 0C 的C 0 2 孵育箱中3 0 -4 0 mi n 。取出后用 K r e b s - HE P E S溶液洗涤 3 次, 以洗尽残留的 F u r a - 2 / A M。用橡皮泥将培养 皿固定于载物台, 将物镜调到荧光镜头, 滤光片调 到F u r a - 2 专用滤片。依次打开荧光显微镜、 荧光 激发光源、 C C D相机、 滤光片转换器及电脑 Me t a - m o r p h 软件。在显微镜
10、下寻找细胞分散均匀、 荧光 标记良 好的视野。用 Me t a m o r p h 选择 3 4 0 n m波 长紫外光激发, 调节焦距至最清晰状态。打开 Me t a f l o u r 软件, 调出测钙相关程序, 先拍摄 1 幅图 片, 并圈选需要观察的细胞。记录3 4 0 / 3 8 0 信号比 值、 范围( 0 - 1 ) , 比值的大小代表 C a 2 + ; 浓度的 高低, 所产生的结果可以自动录入 E x c e l l 软件, 进 行统计分析和作图。 三、 统计学处理 数据以均数士标准差表示, 应用 S P S S统计软 件, 采用单因素完全随机方差分析和 L S D - t
11、检验。 结果 1 II m o l / L A 队- 3 5 作用于海马神经元4 8 h 后, C a 2 + 、 明显增加( P O . 0 5 ) ; 若以1 0 0 f1 m o l / L 五 味子酮共同作用于海马神经元 4 8 h 后, C a 十 1 虽 仍高于空白 对照组( P O . 0 5 ) , 但较单纯A 肠 5 - 3 5 作 用后明显下降( P O . 0 5 ) 。见表 t o 表 1各组神经元内 C a “ 十 ; 相对浓度 细胞数荧光强度组别 A组 B组 c组 0 . 5 9 5 1 士0 . 0 3 1 1 D 0 . 4 1 6 8 士0 . 0 4 6 8
12、 x . 0 . 3 6 1 7 士0 . 0 1 9 7 与C组比较: ) P 0 . 0 5 ; 与 A组比较: ) P 0 . 0 5 讨论 A D是一种脑智能进行性衰退的神经系统退 行性疾病, 是指智能在达到正常水平以后再出现的 进行性衰退。自2 0 世纪 8 0年代以来, 虽然对 A D 7 9 2 的分子生物学研究越来越深人, 但其病因仍不明 确。关于A D的发病机制, 形成了多种学说, 如胆 碱能学说、 瀑布学说、 凋亡学说、 氧化应激学说、 基 因突变学说和兴奋性氨基酸毒性学说等, 这些学说 均不能完全阐明A D的发病机制, 普遍认为A D是 多种病因起源的一种疾病。通过对 A
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