二氧化硫对大鼠肝和肺细胞色素P4502B1和 2E1 MRNA表达及活性的影响.pdf
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1、 第 3 5 卷 5 5 4 2 0 0 6年 卫生研究 J O U R N A L O F H Y G I E N E R E S E A R C H 文章编号: 1 0 0 0 - 8 0 2 0 ( 2 0 0 6 ) 0 5 - 0 5 5 4 - 0 3 V o l . 3 5 N o . 5 S e p . 2 0 0 6 论 著 二氧化硫对大鼠肝和肺细胞色素P 4 5 0 2 B 1 和 2 E I m R N A表达及活性的影响 秦国华孟紫强 山西大学环境医学与毒理学研究所, 太原0 3 0 0 0 6 摘要: 目 的 探讨二氧化硫( s o , ) 对肝、 肺微拉体细胞色 素
2、P 4 5 0 两 种亚型C Y P 2 B 1 和C Y P 2 E I m R N A 表达 及活性的影响。方法 采用S O : 动式染毒技术使雄性W is t a r 大鼠染毒7 天, 每天6 h , S O , 的染毒剂量分别为 1 4 , 2 8 和5 6 m g / 耐。采用分光光度法测定大鼠 肝、 肺微粒体C Y P 2 E I 活性, 采用荧光分光光度法测定肝、 肺微 拉体 C Y P 2 B 1 活性, 采用R T - P C R方法测定各组大鼠肝、 肺组织中C Y P 2 B 1 和 C Y P 2 E I m R N A表达水平。结果 在肝中, 较高 剂量的S 0 2 (
3、 2 8 和5 6 m g / m ) 可使C Y P 2 B 1 活 性及m R N A水平降低, 肝微拉体C Y P 2 E I 活性及 m R N A 在各剂量组均未发生显著改变。肺组织中C Y P 2 B 1 活性在5 6 m g / 耐 剂量组显著降低, 但其m R N A 水平 在2 8 及5 6 m 砂 耐剂量组均显著降低; 肺微粒体C Y P 2 E I 活性及m R N A水平在2 8 及5 6 m g / m S 0 2 处理组均降 低显著。结论s o , 可降低大鼠肝中C Y P 2 B 1 和2 E 1 及肺中C Y P 2 B 1 和C Y P 2 E 1 的活性及m
4、 R N A水平。 关键词: 二氧化硫细胞色素P 4 5 0 2 B 1 中图分类号二 R 9 9 4 . 6 X 5 0 3 . 2 细胞色素P 4 5 0 2 E 1 文献标识码 : A E f f e c t s o f s u l f u r d i o x i d e o n m R N A e x p r e s s i o n a n d a c t i v i t i e s o f h e p a t i c a n d p u l mo n a r y c y t o c h r o me P 4 5 0 2 B 1 a n d 2 E 1 i n r a t s Q i
5、n G u o - h u a , Me n g Z i - g i a n g I n s t i t u t e o f E n v i r o n m e n t a l M e d i c i n e a n d T o x i c o l o g y , S h a n x i U n i v e r s i t y , T a i y u a n 0 3 0 0 0 6 , C h i n a A b s t r a c t : O b j e c t i v e T o s t u d y t h e e ff e c t s o f s u l f u r d i o x i
6、d e ( S O , ) o n a c t i v i t i e s a n d m R N A e x p r e s s i o n o f h e p a t i c a n d p u l m o n a ry c y t o c b r o m e P 4 5 0 2 B 1 a n d 2 E 1 in r a t s . Me t h o d s M a l e Wi s t a r r a t s w e r e h o u s e d i n e x p o s u r e c h a m b e r s a n d tr e a t e d w i t h 1 4 ,
7、 2 8 a n d 5 6 m g / 耐S 0 2 f o r 6 h / d fo r 7 d a y s , w h i le c o n t r o l r a t s w e r e e x p o s e d t o f i lt e r e d a ir in t h e s a m e c o n d i t i o n . T h e a c t i v i t i e s o f C Y P 2 E 1 o f r a t s w e r e m e a s u r e d b y s p e c t r o p h o t o m e t ry. F l u o re
8、s c e n c e s p e c t r o p h o t o m e t ry w a s u s e d t o s t u d y t h e a c t i v i t i e s o f C Y P 2 B 1 . T h e m R N A s o f C Y P 2 B 1 a n d 2 E 1 w e r e a n a l y z e d i n l i v e r s a n d l u n g s b y u s i n g a r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n - p o l y m e r a s e c h a
9、 i n r e a c t i o n ( R T - P C R ) a s s a y . R e s u l t s I n t h e l i v e r , d e c r e a s e s o f C Y P 2 B 1 a c t i v i t y a n d m R N A w e r e o b s e r v e d a t h ig h e r d o s e o f S 0 2 ( 2 8 a n d 5 6 m g / m ) . H o w e v e r , t h e C Y P 2 E 1 一 d e p e n d e n t p - n it r o
10、 p h e n o l h y d r o x y la s e s ( p - N P ) a n d m R N A w e r e u n a l t e r e d b y S 0 2 a t a l l d e t e c t e d c o n c e n t r a t io n s . F o r l u n g s , C Y P 2 B 1 a c t i v i t y w a s u n a l t e r e d b y S 0 2 a t lo w c o n c e n t r a t i o n s , e x c e p t fo r a s ig n if
11、i c a n t d e c r e a s e i n t h e r a ts e x p o s e d to S 0 2 a t 5 6 m g / m , h o w e v e r , S 0 2 a t h i g h e r c o n c e n t r a t io n s ( 2 8 a n d 5 6 m g / 耐) s ig n if ic a n t ly d e c r e a s e d C Y P 2 B 1 m R N A . S ig n if i c a n t in h ib it i o n o f p - N P w a s o b s e r
12、 v e d in l u n g s o f r a t s e x p o s e d t o S 0 2 a t 2 8 a n d 5 6 m g / m . S 0 2 a t h ig h e r c o n c e n t r a t io n s ( 2 8 a n d 5 6 m g / m ) d e c r e a s e d s ig n ifi c a n t l y p u l m o n a ry C Y P 2 E 1 m R N A r e l a t i v e t o c o n t r o l a n i m a l s . C o n c l u s
13、i o n I t w a s s u g g e s t e d t h a t S 0 2 e x p o s u r e c o u l d s u p p r e s s t h e a c t i v i t e s a n d m R N A e x p r e s s io n o f h e p a t i c C Y P 2 B 1 a n d p u l m o n a ry C Y P 2 B 1 a n d 2 E 1 o f r a t s . K e y w o r d s : s u l f u r d i o x i d e , c y t o c h ro m
14、 e P 4 5 0 2 B 1 , c y t o c h r o m e P 4 5 0 2 E 1 二氧化硫( S 0 2 ) 是一种普遍存在的大气污染物, 吸人后会 在体内形成其衍生物重亚硫酸盐和亚硫酸盐( 在中性溶 液中摩尔比为 1 : 3 ) 。这些衍生物又极容易吸收人血液或体 基金项 目: 国家 自然科 学基 金 资助 项 目( N o . 3 0 2 3 0 3 1 0和 2 0 4 7 7 0 2 3 ) ; 山西省自然科学基金资助项目 作者简介: 秦国华, 女, 博士研究生 1 通讯作者 液中而发挥作用。近来作者还发现s o , 及其衍生物为全身性 毒物, 不仅可引起小鼠肺
15、组织, 还可引起小鼠其它多种器官的 D N A 损伤和氧化损伤 1 ,2 1 。细胞色素P 4 5 0 ( P 4 5 0 ) 是存在于肝 脏微粒体混合功能氧化酶系的主要成分, 是一组由许多同工 酶组成的超基因大家族, 对许多内源、 外源性化合物在体内的 I 相生物转化有重要作用, 在药理学、 毒理学研究中有着重要 意义, 尤其对阐明药物一药物的相互作用, 指导临床合理用药 有着非同寻常的意义3 , 除肝脏外, 与外界接触的组织如皮 第 5 期秦国华, 等. 二氧化硫对大鼠肝和肺细胞色素P 4 5 0 2 B 1 和2 E 1 m R N A表达及活性的影响 5 5 5 肤、 肺、 肺泡巨噬细
16、胞等部位亦均有 P 4 5 0 。它可受各种因素 的影响而改变, 如药物、 疾病、 饮食、 激素水平及各种化学物质 等。在本文中我们采用动式s o , 吸人染毒, 对大鼠 肝、 肺微粒 体 C Y P 2 B 1 和2 E 1 的活性及 m R N A水平进行了测定。 图像分析软件 自动扫描 目的条带的灰度, 以目的基因与 G A P D H的灰度之比来确定目的基因的相对表达量。 1 . 6 统计分析 采用O n e - w a y A N O V A 方法分析数据, 结果用x 士: 来表 尔 。 1 材料与方法 1 . 1 主要仪器与试剂 U - 3 0 1 0 型紫外可见分光光谱仪( H
17、I T A C H I ) ; F - 4 5 0 0荧光 分光光度计( H I T A C H I ) ; S O ., 标准气体, 纯度为9 9 . 9 9 % a , 购自 北京氦谱北分气体工业有限公司; N A D P H , 试卤灵, 7 一 戊氧基 试卤灵, 对硝基苯酚和牛血清白蛋白( B S A ) 均购自S ig m a 公 司; 其余试剂均为分析纯。 1 . 2 动物的染毒处理 采用雄性W i s t a r 大鼠, 体重 1 8 0 - 2 0 0 g , 由山西省中医研 究院动物房提供。采用 s o , 吸人染毒法, 实验动物分为对照、 1 4 , 2 8 和5 6 m
18、g / 扩 四个组, 每组6 只大鼠。S 0 2 组每天吸人染 毒6 h , 连续7 d 。对照组也在同类大小的染毒箱中接受相同时 间的过滤的新鲜空气。 将S 0 2 染毒组大鼠置于I M 3 玻璃染毒箱中, s o , 气体由 高压液化 S 0 2 不断输人箱内, 在人口处与不断输人的新鲜空 气混合配成实验所需浓度, 箱顶设有电动搅拌扇, 以使箱内 S 0 2 浓度均匀一致。箱内s o , 浓度采用盐酸副玫瑰苯胺分光 光度法测定, 实际 s o , 浓度测定值分别为( 1 4 . 1 1 士1 . 5 3 ) , ( 2 8 . 3 6 士 2 . 1 2 ) 和( 5 6 . 2 5 土
19、4 . 2 8 ) m g / m 。在s o , 动态吸入染毒 处理时, 动物停止进食和饮水。最后一次处理 1 8 h 后将大鼠 处死, 取出肝、 肺组织, 立即置于液氮保存。 1 . 3 C Y P 2 B 1 活性的测定 采用差速离心法提取肝和肺微粒体。采用考马斯亮兰法 测定微粒体蛋白浓度, 用 B S A做标准曲线。C Y P 2 B 1 的活性用 7 一 戊氧基试卤灵脱烃酶( P R O D ) 来表示。采用荧光分光光度 法测定4 1 , 反应总体积 I m l , 恒温 3 7 9 C , E x = 5 5 0 n m , E m = 5 8 5 n m , 用试卤灵做标准曲线进
20、行计算。 1 . 4 C Y P 2 E 1 活性的测定 C Y P 2 E 1 的活性用对硝基苯酚羚化酶活性来表示, 采用分 光光度法测定( 5 1 . 5 C Y P 2 B 1 和2 E 1 m R N A水平的测定 取1 0 0 m g 肝或肺组织用T ri z o l 提取总R N A , 琼脂糖凝胶电 泳检测 R N A纯度, 分光光度计测定 O D 2 6 0 n m及 O D 2 8 0 n m 。取 2 l cg 总R N A 采用A M V反转录体系合成c D N A 。然后对c D N A 进行C Y P 2 B 1 , C Y P 2 E 1 和G A P D H的P
21、C R 扩增。扩增引物序列 及 产物长度分别为G A P D H F P , 5 - A T G T A T C C G TTG T G G A T C T G A C - 3 ;G A P D H R P , 5 - C C T G C TTC A C C A C C TTC TTG3 , 9 8 饰; C Y P 2 B l F P , 5 - G A G T T C TTC T C T G G G TTC C T G - 3 ; C Y P 2 B 1 R P , 5 一 A C T G T G G G T C A T G G A G A G C T G3 , 5 4 9 b p ; C
22、 Y P 2 E 1 F P , 5 - T C T G A G A T A T G G G C T C C T G A - 3 ; C Y P 2 E 1 R P , 5 一 C G G G G A A T G A C A C A G A G T TT- 3 , 5 5 5 b p 。 反应总体积为 2 0 闪 , 其中含 l l cl c D N A , 3 . 5 m m o l/ L M 邪12 , 0 . 2 m m o U L d N T P , 5 0 0 n m o U L 引物和1 U T a g D N A 聚合酶。 反应条件: G A P D H , 9 4 9 0 2
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