亚低温干预对缺氧缺血新生鼠脑源性神经营养因子MRNA表达的影响.pdf
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1、 8 8 实 验 研 究 亚低温干预对缺氧缺血新生鼠脑源性 神经营养因子 m R N A表达的影响 殷宪 敏杨晓雯 朱桂玉 李静 杨明锋刘钢 林国志 夏作理 【 摘要】 目 的 探讨亚 低温对 缺氧缺血脑 损伤( H I B D ) 新生大鼠 脑源 性神经营养因 子( B D N F ) m R N A 表达的影响。 方法 新生7日 龄W i s t a r 大鼠8 4 只, 随机分为: 假手术组( n = 6 ) , 3 1 亚低 温干预组( n = 3 6 ) , 非亚低温干预组( 对照组, n 二 3 6 ) 及正常对照组( n 二 6 ) 。于分组后6 , 1 2 , 2 4 , 4
2、8 , 7 2 , 9 6 h用原位杂交技术测定B D N F m R N A 。用T u n e l 染色和免疫组化技术检测神经元凋亡数。 结果H I B D缺血再灌注后脑组织B D N F m R N A表达增加, 亚低温组H I B D脑组织B D N F m R N A表达 与未干预组比较差异有统计学意义, 亚低温组脑组织海马、 皮层区细胞凋亡数与未干预组比较差异 有统计学意义。结论亚低温可通过增加H I B D后脑组织海马、 皮层B D N F m R N A的表达水平, 抑 制细胞凋亡而发挥脑保护作用。 【 关键词】 缺氧缺血, 脑; 脑源 性, 神经营 养因 子; 细 胞凋亡 E
3、 f f e c t s o f m i l d h y p o t h e r m i a o n e x p r e s s i o n o f b r a i n - d e r i v e d n e u r o t r o p h i c f a c t o r m R N A i n n e o n a t a l r a t s w i t h h y p o x i c - i s c h e m i c b r a i n d a m a g e Y I N X i a n - m i n , Y A N G X i a o - w e n , Z H U G u i - y
4、 u , L I J i n g , Y A N G M i n g 一n g , L I U G a n g , L I N G u o - z h i , X I A Z u o - l i . T a i s h a n M e d i c a l C o l l o g e A fi a t e d H o s p i t a l , T a i a n 2 7 1 0 0 0 , C h i n a A b s t r a c t ) O b j e c t i v e T o s t u d y t h e e ff e c t o f m il d h y p o t h e r
5、 m ia o n b r a i n - d e r i v e d n e u r o t r o p h i c f a c - t o r ( B D N F ) m R N A i n n e o n a t a l r a t s w i t h h y p o x i c - i s c h e m i c b r a i n d a m a g e ( H I B D ) . Me t h o d s E i g h t - f o u r Wi s t a r r a t s s e l e c t e d f o r t h i s s t u d y t h a t w
6、e r e 7 d a y s o l d a n d w e i g h e d 1 3 t o 1 6 g . T h e r a t s w e r e r a n d o m l y a s s ig n e d i n t o f o u r g r o u p s , c o n t r o l g r o u p( n 二 6 ) , s h a m o p e r a t e d g r o u p( n 二 6 ) , H I B D g r o u p( n = 3 6 ) a n d m i l d h y p o t h e r m i c g ro u p ( n 二
7、 3 6 ) . T h e e x p r e s s i o n o f B D N F m R N A o f b r a i n t i s s u e w a s m e a s u r e d a t 6 、 1 2 、 2 4 , 4 8 、 7 2 a n d 9 6 h b y i n s i t u h y b r i d i z a t i o n . T h e a p o p t o s i s o f n e u r o n s w a s m e a s u r e d b y T u n e l a n d H E k i t . R e s u l t s I
8、 t w a s f o u n d t h a t t h e r e w a s a n i n c r e a s e o f e x p r e s s i o n o f B D N F m R N A i n t h e d e n - t a t e g y ru s a n d h i p p o c a m a p a l C A I a r e a a f t e r h y p o x i c - i s c h e m i c i n j u ry i n r a t s . I t w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r
9、 i n l e v e l o f B D N F m R N A o f r a t s i n m i l d h y p o t h e r m i c g r o u p t h a n t h a t i n H I B D g r o u p . T h e r e w a s s i g n if i c a n t d if fe r e n c e o f a p o p t o s i s i n n e u r o n s i n g y r u s a n d h i p p o c a m a p a l C A I a r e a o f r a t s i n
10、m i l d h y p o t h e r m i a g r o u p c o m p a r e d w i t h t h a t i n H I B D g r o u p . C o n c l u s io n M il d h y p o t h e r m i a c a n p r o t e c t b r a i n t is s u e b y i n c r e as i n g t h e l e v e l o f e x p r e s s i o n o f B D N F m R N A a n d i n h i b i t i n g a p o
11、p t o s i s o f n e u r o n s . K e y w o r d s 】 H y p o x i c - i s c h e m i a ; B r a i n d e r iv e d n e u r o t r o p h ic f a c t o r m R N A ; A p o p t o s i s 新生儿缺氧缺血性脑病( H I E ) 是新生儿期常见 的 神经系 统损害, 积极寻找合理、 安全、 有效的治疗 措施仍是当前新生儿医学的研究重点之一。目 前一 基金 项目: 山 东省卫生 厅科研基金项目 ( 2 0 0 3 H W 1 4 3 ) 作者单位:
12、 2 7 1 0 0 1) 山东泰山医学院附属医院儿科 系列的新生动物实验从神经行为、 组织学形态、 细胞 分子水平证实了 亚低温对H I E的神经保护作用, 但 其脑保护作用的确切机制仍在探索之中。本研究对 缺氧缺血脑损伤( H I B D ) 模型, 采用亚低温干预, 检 测干预前后脑组织 B D N F m R N A的表达及神经元凋 亡数目, 旨在揭示亚低温的脑保护作用机制, 为临床 万方数据 8 9 亚低温的应用提供充分的理论依据。 材料和方法 一、 材料 新生7日龄 W i s t a r 大鼠雌雄不限, 体重 1 3 1 6 g , 共8 4 只, 由山东大学医学院实验动物中心提
13、 供。探针质粒购自中国医学科学院生化研究所, 试 剂盒由B o c h r i n g e r M o n n h e i n a 公司提供。半导体温 度测定仪为上海医用仪表厂产品, B D N F m R N A吸 光度( A ) 测定采用德中公司产品临床病理图像分析 系统。细胞凋亡试剂盒购自 南京建成生物工程研究 所。 二、 方法 1 . H I B D 模型的制备: 按R i c e 法制作。大鼠乙 醚吸人麻醉后取仰卧位, 四肢固定, 取颈正中切口, 结扎左侧颈总动脉, 缝合切口后放回原饲养环境中 恢复2 - 4h , 置2 0 0 0 m l 密闭容器中, 并置于3 7 水浴中, 维持
14、温度3 6 土 I C C , 以2 一 3 Um i n 的速度输 人8 % 的 氧 气 和9 2 % 氮 气的 混 合 气 体, 持 续 缺 氧2 - - 4 h o 2 . 实验动物分组: 8 4只大鼠随机分为: ( 1 ) 假手 术组( n 二 6 ) : 仅游离左颈总动脉, 不做结扎; ( 2 ) 正 常对照组( n = 6 ) : 不作手术处理; ( 3 ) 3 1 亚低温 干预组( n 二 3 6 ) s H I B D模型后置于5 0 0 m l 通气容器 中, 将容器置于3 1 恒温水浴中, 将连接半导体温 度测定仪的温度探头置人大鼠直肠内5 m m处, 连续 监测直肠温度,
15、 使其维持在3 1 %6 h ; ( 4 ) 对照组( n = 3 6 ) : H I B D 模型后置人5 0 0 m l 通气容器中, 不予 干预。 3 . 标本制备及检测: 标本制备( 1 ) 假手术组 于手术后即刻断头取脑, 各观察组及对照组于手术 后6 , 1 2 , 2 4 , 4 8 , 7 2 , 9 6 h断头取脑, O C T包埋后 一 7 0 保存, 冰冻切片机切取1 0 p m厚冠状切片, 取海马和皮层区进行原位杂交检测。( 2 ) 原位杂 交: 根据试剂盒建议反应程序, 将环状质粒用内切酶 S i n I 切成线性板型后再体外转录, 地高辛标记R N A 探针。冰冻切
16、片用4 %多聚甲 醛固 定, P B S 液冼涤, 5 x S S C平衡, 5 8 杂交过夜。杂交后依次用2x S S C 室温, 2 x S S C 6 5 C , 0 . 1 x S S C 6 5洗涤, 加人 地高辛抗体( 1 : 5 0 0 0 ) , 室温2h , 再用缓冲液洗涤, N B T , B C I D显色后, 封片; ( 3 ) B D N F m R N A A测定: 用临床病理图像分析系统进行B D N F m R N A A 测定, 该系统自 动分析所选细胞平均A , 可用于间接反应 B D N F m R N A的 水平; ( 4 ) 光镜检查: 各组术后4 8
17、 h 取丘脑中1 / 3 平面行冠状切片, 常规石蜡包埋后切 片6 W m , 分别进行H E 和T u n e l 染色。 取海马脑皮 质部位以4 x 1 0 0 倍光镜下计数3 个视野中的阳性 细胞数, 将3 个视野的计数总和作为统计参数。 三、 统计学处理 t 检验用S P S S 8 . 5 统计软件进行资料处理, B D - N F m R N A A 及细胞凋亡数目 用i t 。 表示。 结果 1 . 不同部位脑组织 B D N F m R N A的表达: 正常 对照组海马和皮层B D N F m R 1i A 的表达水平分别为 0 . 0 8 1 6 土 0 . 0 0 8 9
18、和0 . 0 7 9 2 土 0 . 0 0 4 6 , 而假手术组 海马和皮层B D N F m R N A的表达水平分别为0 . 0 8 2 1 土 0 . 0 0 8 3 和0 . 0 7 9 5 土 0 . 0 0 4 4 , 两 组间 差异无统计 学意义, t 二 1 . 6 7 和1 . 4 6 , P 0 . 0 5 0 2 . 对照组H I B D后脑组织各部位B D N F m R N A 的表达: 见表t o 表1 对照组不同时相海马和皮层B D N F m R N A 表达水平( 无 士 : ) H I B D后时间( h )海 马 B D N F A皮层 B D N F
19、 A 0 . 0 7 9 2 10 . 0 0 3 2 0 . 0 8 1 1 t 0 . 0 0 2 2 0 . 的 1 21 0 . 0 1 26 0 . 0 9 5 2 to . 0 0 6 7 0 . 1 0 6 7 t 0 . 0 0 8 3 0 . 1 0 9 3 10 . 0 0 1 9 0 . 0 8 1 7 10 . 0 0 2 7 0 . 0 8 1 9 to . 0 0 1 8 0 . 0 8 2 6 1 0 . 0 0 1 9 0 . 0 8 5 0 1 0 . 加 23 0 . ( 阴) 4 10 . 0 0 21 0 . 0 9 5 6 1 0 . 0 0 3 7
20、612244872% 3 . 亚低温组和对照组海马区B D N F m R N A水 平的比较, 见表2 0 表2B D NF mR NA H I B D后 时间( h ) 亚低温组与对照组不同时相海马 表达水平比 较( 云 土 : ) 3 1 亚低温组对照组 B D N F B DN F A A t尸 0 . 0 8 0 01 0 . 0 0 31 0 . 0 7 9 21 0 . 0 0 3 2 1 . 8 3 4 0 . 0 9 1 2土 0 . 0 0 21 0 . 0 8 1 1 1 0 . 0 0 2 2 2 . 0 9 1 0 . 的561 0 . 加3 8 0 . 的1 21
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