人CXCR1基因TETON可调控载体的构建及其在NIH3T3中的表达.pdf
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1、2 8 0I S S N 1 0 0 7 一 8 7 3 8 细胞与分子免疫学杂志( C h i n J C e l l M o t I m m u n o l ) 2 0 0 6 , 2 2 ( 3 论著文章编号: 1 0 0 7 一 8 7 3 8 ( 2 0 0 6 ) 0 3 一 0 2 8 0 一 0 3 人 C X C R 1 基因T e t - o n 可调控载体的构建及其在 N I H 3 T 3中的表达 史曼, 药立波, 王立峰, 李福洋, 苏 金, 张 健, 李霞, 刘新平* ( 第四军医大学生物化学与分子生物学教研室, 陕西 西安 7 1 0 0 3 2 ) Co n s
2、 t r u c t i o n o f T e t - o n i n d u c i b l e CX- C R 1 e u k a r y o t i c e x p r e s s i o n p l a s m i d a n d 记e n t i f i c a t i o n o f t h e t e r i n NI H3 T 3 c e l l e x p r e s s i o n c h a r a c - S H I M a n , Y A O L i - b o , W A N G L i f e n g , L I F u - y a n g , S U J i
3、n , Z H A N G J i a n , L I X i a , L I U X i n p i n g * D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y a n d M o l e c u l a r b i o l o g y , F o u rt h M i l i t a r y M e d i c a l U n i v e r s i t y , X i a n 7 1 0 0 3 2 , C h i n a A b s t r a c t A I M; T o c o n s t r u c t t e t r a c y
4、c lin e( T e t ) - c o n - t r o lle d in d u c ib le v e c t o r C X C R 1 - p T R E h y g , a n d t h e n d e t e c t t h e e x p r e s s io n c h a r a c t e r o f C X C R I u n d e r t h e r e g u la t io n o f D o x in N I H 3 T 3 c e lls . ME T H O D S : A f u l l le n g t h c D N A o f h u -
5、m a n C X C R I w a s c lo n e d f r o m s a m p le o f f i b r a b la s t li k e s y n o - v iu m( F L S )in r h e u m a t o id a rt h r it is( R A )p a t ie n t b y R T - P C R . a n d t h e n s u b - c lo n e d in t o t h e p T R E h y g p la s m id - a ft e r s e q u e n c e a n a ly s is . C X
6、C R 1 - p T R E h y g a n d p T e t - o n w a s c o - t r a n s f e c t e d w it h L ip o f e c t 2 0 0 0 t o N I H 3 T 3 c e lls , a n d t h e e x - p r e s s io n o f I L - 8 R A w a s d e t e c t e d b y We s t e r n b lo t a ft e r g iv e n d if f e r e n t c o n d e n s e o f D o x . R E S U L
7、T S : We s t e r n b lo t s h o w e d t h a t C X C R I c o u ld b e in d u c e d b y D o x in N I H 3 T 3 c e lls , a n d t h e p h o s p h o ry la t e d E r k - 1 / 2 le v e l w a s s ig n if ic a n t ly in c r e a s e d a ft e r I L - 8 s t imu la t io n . C ON C L U S I ON: 丁 e t i n d u c ib le
8、 r e c o m- b in a n t v e c t o r o f C X C R I - p T R E h y g w a s s u c c e s s f u lly c o n - s t r u c t e d , a n d it c o u ld b e e x p r e s s e d i n N I H 3 T 3 c e lls.T h e s t im u la t io n o f I L - 8 o b v io u s ly c h a n g e d t h e a c t iv it y o f E r k - 1 / 2 i n t h e t
9、r a n s f e c t e d N I H 3 T 3 c e l l s . T h i s w o r k h a s l a i d f o u n d a - t io n s f o r f u rt h e r s t u d y o n t h e r e la t io n s h ip b e t w e e n C X C R I a n d R A d i s e a s e . K e y w o r d s C X C R I ; in d u c ib le e x p r e s s io n v e c t o r ; R A 胞中克隆得到C X C R
10、 I 的全长基因, 测序正确后将其亚克隆人 p T R E h y g 载体中二 用脂质体将p T e t - o n 质粒和C X C R I - p T R E - h y g 共转染人N I H 3 T 3 细胞, 以 不同浓度的强力霉素诱导, 用 We s t e rn b l o t 检测 C X C R I 蛋白表达水平。结果: We s t e rn b l o t 显示, 我们所构建的可调控性表达载体能在N I H 3 T 3 细胞内 表达, 不同浓度药物诱导的C X C R I 表达水平明显不同; 同时 还观察到I L - 8 刺激后, N I H 3 T 3 细胞中E r
11、k - 1 / 2 磷酸化水平升 高。结论: 成功构建了C X C R I - p T R E h y g 真核表达载体, 并可 在N I H 3 T 3 细胞内表达。经 I L - 8 刺激的转染 N I H 3 T 3细胞中 E r k - 1 / 2 活性发生变化。 一 为进一步观察C X C R I 与类风湿性关 节炎损伤之间的关系奠定了基础。 关键词C X C R I ; 可调控表达载体; 类风湿性关节炎 中图分类号8 3 9 2 . 1 1 文献标识码A 摘要 目的: 构建C X C R I - p T R E h y g 可调控性真核表达载 体, 检测其在N I H 3 T 3
12、细胞内的表达情况。方法: 通过R T - P C R的方法从原代培养的类风湿性关节炎患者滑膜成纤维细 收稿日 期: 2 0 0 6 - 0 3 一 1 6 ; 修回日 期: 2 0 0 6 - 0 3 - 3 1 基金项目: 国家重点基拙研究发展规划( 9 7 3 ) 资助( N o . 国 家自 然 科学 基 金资 助 项目 ( N o . 3 0 3 0 0 3 1 9 , 作者简介: 史曼( 1 9 7 9 一 ) , 女, 陕西西安人, 助教, 2 0 0 2 C B 5 1 3 0 0 7 ) ; 3 0 5 7 1 7 3 4 ) 硕 士 生. * C o r re s p o n
13、 d i n g a u t h o r , E m a i l ; x i n p i n g l i u f m m u . e d u . e n 趋 化因 子( c h e m o k i n e ) 是一 类可 诱导的 促炎细 胞 因 子, 其相对分子质量( 从) 为7 0 0 ( ) 一 1 0 0 0 0 , 可由多 种细胞产生, 具有激活和趋化白细胞的作用。近年 发现, 趋化因子除了刺激多种细胞发生趋化游走外, 在肿 瘤细 胞增殖中 还具有生长因 子样作用 , 趋化 因子的生物学效应是通过其受体介导的。类风湿性 关节炎 ( r h e u m a t o i d a r th
14、r i t i s , R A ) 是一种慢性、 系统 性疾病, 以大量炎性细胞浸润、 滑膜组织的异常增生 及关节软骨和骨的进行性破坏为特征。滑膜增生是 R A中主要的病理变化, 研究显示, 增生的滑膜主要 以 成纤维样滑膜细胞( f i b r a b l a s t l i k e s y n o v i u m , F L S ) 为主, 且该细胞表现为核大、 苍白、 核仁突出等肿瘤 样细 胞的 特性 。 大量炎性细胞所分泌的趋化因子 能否促进F L S 增殖, 并最终导致滑膜增生成为我们 关注的重点。本研究中以趋化因子中最常见的I L - 8 为研究对象, 观察I L - 8 通过其
15、A型受体( I L - 8 R A , C X C R 1 ) 对F L S的影响。我们以C X C R 1 为靶基因构 建一种可调控的真核表达载体 , 以实现人为控制 的C X C R I 的表达, 力求模拟真实的病理条件下I L - 8 对F L S 的作用。 四环素可诱导系统 ( T e t - o n 和T e t - o f f )是人工设 计的一种基因表达的调控模式。应用四环素或其衍 生物强力霉素 ( d o x y c y c l i n e , D o x )可诱导或抑制基 I S S N I 0 0 7一 8 7 3 8 细胞与分子免疫学杂志( C h i n J C e l
16、 l M o l I m m u n o l ) 2 0 0 6 , 2 2 ( 3 ) 2 8 1 因 转录 4 1 。 这个系统在体外和动物实验中都表现出 良 好的表达调控作用, 对目的基因的表达可进行精 细的调节。本研究应用该系统, 为将来稳定转染小 鼠N I H 3 T 3 细胞 5 1 , 方便快捷地研究I L - 8 在R A中 促 进 F L S 发生过度增殖的机制奠定了基础。 1 材料和方法 1 . 1 材料 T e t - O n 表达系统, 脂质体L i p o f e c t A M I N 2 0 0 0 T M 购白I n v i t ro g e n 公司, 新生牛
17、血清购自 杭州四季清生物试剂公 司, N I H 3 T 3 细胞由本室保存。限制性内切酶M l u I 和S a l I , T 4 D N A连接酶, p M D - 1 8 T 载体均购自T a K a R a 公司。 小量质 粒抽提试剂盒、 胶回收试剂盒购自安徽优晶生物工程有限公 司。细胞培养基D M E M购自G i b i c o 公司。 1 . 2 方法 1 . 2 . 1 细胞培养小鼠N I H 3 T 3 细胞, 采用含 1 0 0 m UL F B S 的D M E M培养基, 在3 7 9 0 , 5 0 m UL C O : 条件下培养。待细 胞在6 孔细胞培养板内长到
18、8 0 %时, 进行转染。 1 . 2 . 2 引物设计根据 G e n B a n k ( N M -0 0 6 3 4 ) 已收录的 C X - C R l c D N A全长序列设计特异性引物, 引物序列如下: 上游引 物:5 - G C A C G C G T A A A C C A TTG C T G A A A C T G A A G A G G - 3 ;下 游引物: 5 - G C G T C G A C G A T G G 1 I “ 1 1 C A G A G G T T G G A A G A G - 3 a 其中上游引物的A C G C G T 序列为M l u I 酶
19、切位点, 下游引物 的G T C G A C 序列为S a l I 酶切位点。所设计引物送上海生物 工程公司合成。 1 . 2 . 3 模板制备加1 m l , T r i z o l 到N I H 3 T 3 细胞中, 用1 m l , 的注射针管反复抽提1 0 次, 在4 C , 1 2 0 0 0 g 离心1 0 m i n , 上 清转人另一离心管, 加人0 . 2 m L氯仿, 震荡混匀后4 9 C , 1 2 0 0 0 g 离心1 0 m i n , 小心吸取上清, 加人0 . 5 m L 异丙醇, 放置1 0 m i n 后, 4 C, 1 2 0 0 0 g 离心1 0 m
20、i n , 沉淀用7 5 0 m UL 乙醇洗涤, 待乙醇挥发干后溶于2 0 W L D E P C 处理过的去离 子水中。 1 . 2 . 4 P C R扩增、 克隆及序列测定 在1 0 0 w L 反应体系中 加人1 0 x 反应缓冲液1 0 p L , d N T P ( 2 . 5 m m o U L ) 8 p ,L , 上下 游引物( 1 0 ft m m o U L ) 各4 W L , 模板D N A 4 p , L , p f u 高保真 D N A聚合酶2 p ,L , 补水至1 0 0 w L 。 扩增条件为9 4 9 C 3 m i n , 9 4 c C 1 m i
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- CXCR1 基因 TETON 调控 载体 构建 及其 NIH3T3 中的 表达
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