人CANSTATIN基因克隆及其重组蛋白的表达和纯化.pdf
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1、人c a n s t a t i n基因克隆及其重组蛋白的表达和纯化 何小平 李兆申 屠振兴 高 军 潘 雪 龚燕芳 金 晶 摘 要 目的 克隆人血管能抑素c a n s t a t i n基因, 构建其原核表达载体, 表达并纯化出c a n s t a t i n蛋白。方法 从人胎盘组织中 提取总R N A, 经R T - P C R扩增出c a n s t a t i n基因, 克隆进质粒p U C m - T, 将测序正确的目的基因片段插入质粒p E T - 2 2 b(+) 相应位点, 转化E.c o l iB L 2 1, I P T G诱导蛋白表达。超声破碎菌体,N i - N T
2、 A柱亲和层析纯化重组蛋白。结果 从人胎盘组织中提取总R N A, 显示3条清晰条带, 分别对应2 8 S, 1 8 S,5 S, 分光光度计法测得总R N A浓度为1 . 8 g/L;R T - P C R扩增出与预期目的基因c a n s t a t i n长度 一致的c D N A片段; 构建出克隆质粒p U C m - T/c a n s t a t i n, 基因测序结果与G e n B a n k公布的c a n s t a t i n基因序列完全一致; 构建出表达质 粒p E T - 2 2 b(+) /c a n s t a t i n, B a mH-和H i n d,双酶切
3、鉴定证实构建正确;I P T G诱导蛋白表达,S D S - P A G E电泳分析表明在相对分子 质量2 4 k D左右出现新的蛋白表达条带, 诱导后1 h、2 h、3 h、4 h表达蛋白占菌体总蛋白的百分比分别为1 8 . 2 %、1 8 . 8 %、2 3 . 0 %和 2 3 . 4 %; 诱导3 h的菌体超声破碎后,N i柱亲和层析,1 2 5、2 5 0 m m o l/L咪唑洗脱液S D S - P A G E电泳显示出清晰的单一条带。结论 成 功克隆出c a n s t a t i n基因, 成功构建了其原核表达载体, 并且成功表达、 纯化出c a n s t a t i n蛋
4、白, 为进一步研究其临床应用打下基础。 关键词 基因,c a n s t a t i n; 血管生成; 基因克隆; 蛋白纯化 中国图书资料分类号 R 7 3 C l o n i n go f h u m a nc a n s t a t i ng e n e,e x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o no f i t s r e c o m b i n a n t p r o t e i n H eX i a o p i n g,L iZ h a o s h e n,T uZ h e n x i n ge t a l. D e p a r t
5、m e n to fG a s t r o e n t e r o l o g y ,C h a n g h a iH o s p i t a l,S e c o n d M i l i t a r yM e d i c a lU n i v e r s i t y,S h a n g h a i 2 0 0 4 3 3,C h i n a A b s t r a c t O b j e c t i v e T oc l o n eh u m a nc a n s t a t i ng e n e,c o n s t r u c t i t sp r o k a r y o t i c e x
6、 p r e s s i o nv e c t o r,e x p r e s s a n dp u r i f y i t s r e c o m b i n a n t p r o t e i n .M e t h o d s T h e t o t a lR N Aw a s e x t r a c t e d f r o mh u m a np l a c e n t a t i s s u e s . T h e c a n s t a t i ng e n e f r a g m e n tw a s s y n t h e s i z e da n da m p l i f i
7、e d f r o mt h e t o t a lR N Ab yR T - P C R. T h e r e s u l t i n gp r o d u c tw a s c l o n e d i n t op U C m - Tv e c t o r a n d s e q u e n c e d . T h e n t h e c o n f i r m e d c a n s t a t i n c D - N Aw a s c l o n e d i n t op l a s m i dp E T - 2 2 b(+)a n d t h e n t r a n s f o r
8、m e d i n t oE.c o l iB L 2 1w h e r e i tw a s i n d u c e d t o e x p r e s sp r o t e i n sb y i s o p r o p y l - 1 - t h i o - b - D g a l a c t o p y r a n o s i d e(I P T G). T h e e x p r e s s i o no f p r o t e i nw a s a n a l y z e d t h r o u g hS D S - P A G E. C e l l s a f t e r i n
9、d u c e d 3h o u r s b y I P T Gw e r e h a r v e s t e d,s o n i c a t e db r i e f l ya n dt h ep r o t e i n sw e r ep u r i f i e dt h r o u g ha f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y . R e s u l t s (1)T h ee x t r a c t e dt o t a lR N Aw a s s e p a r a t e d i n t o t h r e e c l e a rb a
10、 n d s i n d i c a t i n g2 8 S,1 8 S,a n d5 Sa f t e re l e c t r o p h o r e s i sa n dt h ec o n c e n t r a t i o nw a s1 . 8g/L.(2)T h e t a r g e t s e - q u e n c e sw e r es p e c i f i c a l l ya m p l i f i e dt h r o u g hR T - P C R.(3)T h ep u r i f i e dR T - P C Rp r o d u c tw a sc l
11、 o n e di n t op U C m - Tv e c t o ra n dt h e ns e - q u e n c e d,d e m o n s t r a t i n g t ob e t h e s a m e a s t h a t o f c a n s t a t i ng e n e i nG e n B a n k .( 4)t h e e x p r e s s i o nv e c t o r p E T - 2 2 b(+)w a s c o n s t r u c t e da n d v e r i f i e db y t h em e t h o d
12、o fB a mH- a n dH i n d,d i g e s t i o n .(5)A f t e r I P T Gi n d u c t i o n,t h e r ew a san e wp r o t e i nb a n da b o u tM r2 4 k Do n S D S - P A G E. T h ep e r c e n t e x p r e s s e dp r o d u c to v e rt o t a lb a c t e r i a lp r o t e i n sa f t e r1,2,3,a n d4h o u r so f i n d u
13、c t i o nw a s1 8 . 2 %,1 8 . 8 %, 2 3 . 0 %a n d2 3 . 4 %,r e s p e c t i v e l y,e s t i m a t e db yd e n s i t o m e t r y .(6)A f t e r a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y,S D S - P A G Es h o w e do n l yo n ec l e a rb a n d e x i s t e d i n1 2 5m m o l/Lo r 2 5 0m m o l/L i m i d i z
14、 o n e e l u t i o n . C o n c l u s i o n H u m a n c a n s t a t i ng e n eh a sb e e n s u c c e s s f u l l y c l o n e da n d i t sp r o k a r y - o t i c e x p r e s s i o nv e c t o rh a sa l s ob e e ns u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d . F u r t h e rm o r e,p u r i f i e dr e c o
15、m b i n a n tp r o t e i n sa r eo b t a i n e dt h r o u g ha f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y,l a y i n g f o u n d a t i o n f o r f u r t h e r s t u d yo f i t s c l i n i c a l a p p l i c a t i o n . K e yw o r d s g e n e s,c a n s t a t i n;a g i o g e n e s i s;g e n e c l o n i n
16、 g;p r o t e i np u r i f i c a t i o n c a n s t a t i n是2 0 0 0年由K a m p h a u s等 1发现的一种 新的血管生成抑制素, 初步研究表明其具有抑制新生 血管的形成, 抑制肿瘤生长的作用。为深入研究c a n - s t a t i n抗血管生成和抗肿瘤作用, 本文作者克隆其基因 序列, 构建出其原核表达载体, 并成功表达和纯化了重 组c a n s t a t i n蛋白, 为进一步临床应用打下基础。现报 道如下。 1 材料与方法 1 . 1 实验材料 E.c o l iD H 5 由本实验室保存; E. c o
17、l iB L 2 1和表达质粒p E T - 2 2 b(+) 购自复旦大学生命 科学院; 克隆质粒p U C m - T购自上海申能博彩生物科 技有限公司; 限制性内切酶B a mH-,H i n d, T 4D N A 连接酶及D N A分子大小标准购于N E B公司( 基因公 司代理) ; 低分子量标准蛋白质购于上海生工生物工程 公司; T r i z o l购自晶美公司;R T - P C R试剂盒购自宝生 物工程( 大连) 有限公司; I P T G、X - g a l、 质粒回收试剂 盒、 胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司;N i - N A T蛋白亲和纯化试剂盒购自Q i
18、 a g e n公司( 基因公司 代理) 。胎盘组织来自本院妇产科一剖宫产产妇。引 作者简介: 何小平, 博士生, 主治医师。主要从事肿瘤抗血管生成领域研 究, 已发表论文2 2篇, 参编专著3部 作者单位:2 0 0 4 3 3 上海 上海长海医院消化内科( 何小平、 李兆申、 屠 振兴、 高 军、 潘 雪、 龚燕芳、 金 晶) 通信作者: 李兆申,E - m a i l:z h s l i 0 c h x h . c o m 基金项目: 上海市科委基础研究重大项目( 编号0 3 J C 1 4 0 0 7) 436 解放军医学杂志2 0 0 5年7月 第3 0卷 第7期M e dJC h
19、i nP L AV o l 3 0N o7J u l y2 0 0 5 物根据G e n B a n k中报告的c a n s t a t i n序列设计而成。 上下游引物5 端分别携带B a mH-和H i n d,酶切位 点, 由上海生工生物工程公司合成。上游引物: 5 - C G G G A T C C T G T C A G C A T C G G C T A C C T C- 3 ; 下游引 物: 5 - C C C AA G C TT C A G G T T C T T C A T G C A C A C - 3 。 1 . 2 实验方法 1 . 2 . 1 人胎盘组织总R N A
20、提取 将液氮冻存的新鲜 胎盘组织约1 0 0 m g放入研钵中, 倒入少许液氮, 尽力研 磨使其成为粉末状。T r i z o l一步法提取总R N A, 分光 光度法测定R N A纯度和量。 1 . 2 . 2 R T - P C R扩增目的基因 按照R T - P C R试剂 盒提供方法扩增c a n s t a t i n基因。反应体系为: 1 0一 步法P C R反应 缓 冲 液5 l;2 5 m m o l /L M g C l 21 0l; 1 0 m m o l /Ld N T P5 l;4 0 m U/L核糖核酸酶抑制剂1 l; 5 m U/LAMV逆转录酶1 l;5 m U/
21、LAMV - O p t i m i z e d T a qD N A聚合酶1 l;2 5 m o l /L上下游引物各1 l; 1 . 8 g /LR N A模板1 l; 无核酸酶双蒸水2 4 l。R T - P C R反 应 条 件:5 0 4 0 m i n,9 4 2 m i n,9 4 4 0 s, 5 2 . 6 4 0 s,7 2 1 m i n,3 5次循环后,7 2 延伸5 m i n。 1 0 g /L琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。按胶回收试剂 盒提供方法, 回收目的基因片段。 1 . 2 . 3 P C R产物的克隆 连接反应体系1 0 l: 连接缓 冲液1 l,p U C
22、 m - T1 . 5 l(5 0 n g) , 纯化P C R产物6 . 5 l, T 4D N A连接酶1 l,1 6 连接过夜。取3 l上述连接 反应液电转化感受态E.c o l iD H 5 。涂布铺有I P T G 及X - g a l的含氨苄青霉素的L B琼脂平板, 3 7 培养过 夜, 进行蓝白斑筛选。 1 . 2 . 4 阳性重组克隆的筛选 挑取白色菌落6个, 接 种于含5 l 0 . 1g /L氨苄青霉素的5 m lL B培养液中, 3 7 振荡培养过夜。用按试剂盒提供的碱裂解法制备 质粒D N A, 用B a mH-,H i n d,分别做两次单酶切, 1 0 g /L琼脂
23、糖凝胶电泳, 鉴定阳性克隆, 命名为p U C m - T/c a n s t a t i n。 1 . 2 . 5 序列测定 取含有重组质粒的菌液1 m l , 以 M 1 3 -/T 7为序列分析引物利用S a n g e r双脱氧链终止 法正反两端对p U C m - T中目的基因进行序列分析。 1 . 2 . 6 C a n s t a t i n原核表达载体的构建 测序证实正 确的重组质粒经B a mH-和H i n d,双酶切后, 胶回收 c a n s t a t i n目的基因片段。同样的方法处理质粒p E T - 2 2 b(+) 。回收的目的基因片段与处理的p E T -
24、2 2 b(+) 质粒在T 4D N A连接酶作用下, 1 6 连接过夜, 得到的 连接产物电穿孔转化E.c o l iB L 2 1, 涂布含氨苄青霉素 的L B琼脂平板, 3 7 培养过夜。挑取白色菌落7个, 碱裂解法制备质粒D N A, 用B a mH-,H i n d,做双单酶 切鉴定阳性克隆。 1 . 2 . 7 重组蛋白的表达 挑取阳性克隆入5 m l含氨 苄青霉素的L B培养基中, 3 7 振荡过夜培养。次晨取 1 0 0 l接种到新的5 m l含氨苄青霉素的L B培养基, 3 7 , 振荡培养3 . 5 h, 至O D值约0 . 6, 加入I P T G至终 浓度为0 . 5
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- CANSTATIN 基因 克隆 及其 重组 蛋白 表达 纯化
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