人FXR基因5调控区功能分析.pdf
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1、I S S N CN 1 0 0 7 - 7 6 2 6中国生物化学与分子生物学报 1 1 - 3 8 7 0 / Q C h i n e s e J o u rna l o f B i o c h e m i s t r y a n d M o l e c u l a r B i o l o 2 0 0 6年 4月 2 2 ( 4 ) : 3 2 2 一 3 2 7 人F X R基因5 调控区功能分析 娄桂予, 陈 敏,李渝萍,李 强, 陈 彬, ( 第三军医大学生物化学与分子生物学教研室, 陈 健,廖荣霞,周度金 重庆4 0 0 0 3 8 ) 摘要为研究人法尼醋衍生物 X受体( F X
2、R ) 基因5 调控区的功能, 在对人 F X R基因进行生物信息 学分析的基拙上, 用5 R A C E法确定该基因的转录起始位点碱基是 A. 采用P C R技术, 扩增人基因 组D N A中F X R基因5 上游序列, 构建了5 种含不同长度启动子序列的荧光素酶报告基因表达体 系. 将它们瞬时 转染H e p G 2 细胞, 检测其荧 光素酶活性. 结果表明, - 1 6 5 1 一十 2 0 0 , - 1 4 %一十 2 0 0 区域的启动子活性无明显区别, - 8 4 7 一+ 2 0 0区域的启动子活性最高, 一 5 4 4一+ 2 0 0区域启动子 活性较前显著降低. 研究提示,
3、 F X R基因转录所必需的基因启动子序列在 一 8 4 7 - - 5 4 4范围内. 关键词法尼酣衍生物X受体; 启动子; 转录调控 中图分类号Q 7 8 F u n c t i o n a l C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e 5 - F l a n k i n g R e g i o n o f H u ma n F X R G e n e L O U G u i - Y u , C H E N M i n , L I Y u - P i n g , L I Q i a n g , C H E N B i n , C H E N B a
4、 n , L i a o R o n g - X i a , ( D e p a rt m e n t of B i o c h e m is t r y a n d M o l e c u l a r B i o l o g y , T h i r d M i l i t a r y M e d i c a l U n iv e r s it y , C h o n g g in g 4 0 0 0 3 8 , Z H O U D u - J i n C h i n a ) A b s t r a c t T o s t u d y t h e f u n c t i o n o f t h
5、 e 5 - fl a n k i n g r e g io n o f h u m a n f a rn e s o i d X r e c e t o r( F X R ) ,th e t r a n s c r i p t i o n s t a r t s i t e w a s fi r s t l y i d e n t i f i e d b y t h e 5 一 R A C E , t h e n f i v e l u c i f e r a s e e x p r e s s i o n v e c t o r s w h i c h c o n t a i n e d
6、p o t e n t i a l h u m a n F X R g e n e p r o m o t e r w e re c o n s t ru c t e d , i n c l u d i n g p G L 3 b a s i c F X R( 一 1 6 5 1 - + 2 0 0 ) , p G L 3 b a s i c F X R( 一 1 4 9 6 一+ 2 0 0 ) , p G L 3 b a s i c F X R( 一8 4 7一+2 0 0 ) , p G L 3 b a s i c F X R ( 一 5 4 4 一+ 2 0 0 ) , p G L 3
7、 b a s i c F X R ( 一 5 4 4 一+ 4 6 ) . A l l e x p r e s s i o n v e c t o r s w e r e t r a n s f e c t e d i n t o H e p G 2 c e l l l i n e . T h e l u c i f e r a s e a c t i v i t y i n e a c h c e l l l y s a t e w a s m e a s u r e d . R e s u l t s s h o w e d t h a t t h e r e w e r e n o s
8、i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e l u c i f e r a s e a c t i v i t y o f t h e r e g i o n一1 6 5 1 一+ 2 0 0 a n d一1 4 9 6 一+ 2 0 0 . T h e a c t i v i t y o f 一 8 4 7 一+ 2 0 0 w a s t h e h i g h e s t , a n d一 5 4 4 一+ 2 0 0 w a s t h e l o w e s t . T h e r e s u l t s s
9、 u g g e s t t h a t t h e r e g i o n ( 一 8 4 7 -一 5 4 4 ) i n c l u d e s a n e s s e n t i a l p r o m o t e r f o r h u m a n F X R g e n e t r a n s c r i p t i o n . K e y w o r d s f a rn e s o i d X r e c e t o r ; p r o m o t e r ; t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n 法尼醋衍生物 X受
10、体( f a rn e s o i d X r e c e t o r , F X R ) 又称为胆汁酸受体, 是一种配体依赖性转录因子, 属 于核受体超家族的一员. F X R主要表达于肝脏、 小 肠、 肾及肾上腺等组织, 在心脏和脂肪组织中也有一 定水平表达. F X R通过调控参与代谢的一些关键酶 的转录, 在体内发挥着维持机体胆汁酸代谢和脂代 谢平衡的作用 一 I . 目前 F X R研究的重点主要集中在寻找 F X R新 的配体、 靶基因以及探讨其与核受体辅活化子之间 相互作用等, 而对 F X R转录调控的研究鲜有报道. 事实上, F X R自 身表达水平的改变是影响脂代谢平 衡的
11、重要因素, 而 F X R转录调控的机制目前尚不清 楚. 因此, 本研究利用5 R A C E确定了 F X R转录起始 位点, 克隆了人 F X R基因5 调控区并对其功能进行 了初步分析. 1 材料与方法 1 . 1 材料 收稿 日 期: 2 0 0 5 - 0 8 - 1 6 , 接受日期: 2 0 0 5 - 1 1 - 1 4 国家自 然科学基金资助项目( N o : 3 0 3 7 0 3 1 7 , 3 0 3 0 0 1 2 6 ) 联系人T e l : ( 0 2 3 ) 6 8 7 7 5 1 9 0 , E - m a il : d u j i n z h o u y a
12、 h o o . c o m R e c e i v e d : A u g u s t 1 6 , 2 0 0 5 ; A c c e p t e d : N o v e m b e r 1 4 , 2 0 0 5 S u p p o rt e d b y N a t i o n a l N a t u r a l S c i e n c e F o u n d a t i o n o f c h i n a ( N o . 3 0 3 7 0 3 1 7 , 3 0 3 0 0 1 2 6 ) C o r r e s p o n d i n g a u t h o r T e l : (
13、0 2 3 ) 6 8 7 7 5 1 9 0 E - m a i l : d u j i n z h o u y a h o o . c o m 第 4 期娄桂予等: 人 F X R基因5 调控区功能分析 人肝癌细胞H e p G 2 为本实验室保存; D M E M 、 胎 牛 血清购于H y c l o n e 公司; F i r s t C h o i c e T M R L M . R A C E K it购 自 A m b i o n公 司; P C R 产 物 克 隆 载 体 p C R 2 . I T O P O v e c t o r 购自Q i a g e n 公司. 实验
14、中 所用引 物用P r i m e r p r e m i e r 5 . 0 软件设计, 由上海生工生物技 术公司合成. 1 . 2 生物信息学分析 通过登陆美国生物技术信息中心的 G e n R a n k ( h t t p : / / w w w . n e b i . n l m . n i h . g o v / W e b / G e n B a n k ) 查找 人 F X R c D N A序列( 序列号为 U 6 8 2 3 3 ) . 将该序列与 人F X R基因( h t t p : / / g e n o m e . u c s c . e d u / c g i -
15、 b i n / h g b l a t ) 进行比对, 得出 F X R基因外显子和内含子在基因中 的构成, 获取从第一个外显子及其5 上游约3 0 0 0 b y 的序列, 利用启动子分析软件, 预测启动子区域. 应 用t r a n s F a c p r o f e s s i o n a l 8 . 1 软件对该区域进行搜索, 获得可能的转录因子结合位点 1 . 3 转录起始点的确定 T r i p u r e 法提取培养的H e p G 2 细胞中的总R N A. 根据 F X R m R N A已知序列设计对照引物 ( 5 - C C T C A T T G T C T C C
16、C C G A C T P A T C C T - 3 ) 和下游引物( 即 为内侧反向引物: 5 - G C C T C T A G A A A G C A G T G TTC A C T TTG - 3 ) . R T - P C R扩增片段, 验证提取总 R N A的质 量及表达情况. 应用 5 R A C E方法确定转录起始点 的位置( 按 A m b i o n公司 R L M - R A C E K i t 说明书操 作) . 实验方法简述如下: 首先, 用碱性磷酸酶 C I P 切 除总R N A ( 1 0 p g ) 中含有的5 末端带磷酸根的序列 如r R N A , t
17、R N A和未完全除去的D N A . 然后用烟草酸 性焦磷酸酶切除m R N A 5 帽子结构, 但保留5 端磷 酸根, 利于T 4 R N A连接酶将接头( 5 R A C E a d a p t o r ) 连接到此位置上, 用 M - M L V逆转录酶合成 c D N A第 一链. 而后根据 F X R - m R N A序列设计2 个反向特异 引物, 以 c D N A为模板进行巢式 P C R 外侧反向引 物: 5 - C T G T G G T A G G T A A A T G G G A A T G - 3 , 内侧反向 引物: 5 - G C C T C T A G A
18、A A G C A G T G T F C A C T 1 T G - 3 . 2 个正向引物由试剂盒提供( 分别根据 5 R A C E接头 序列设计) . P C R产物克隆至p C R I I - T O P O T A载体, 对P C R片段测序, 分析测序结果. 1 . 4 重组体构建 载体质粒p G L 3 b a s i c 不含启动子和增强子, 但 含有虫荧光素酶报告基因, 重组体中所含的启动子 即是所要研究的 F X R 5 端启动子片段. 5 个构建的 重组体分别命名为 p G L 3 b a s i c F X R ( - 1 6 5 1 - + 2 0 0 ) 、 p
19、G L 3 b a s i c F X R( 一 1 4 9 6 一+2 0 0 ) 、 p G 1 .3 b a s i c F X R ( 一 8 4 7 一+ 2 0 0 ) , p G L 3 b a s i c F X R ( 一 5 4 4 - + 2 0 0 ) , p G L 3 b a s ic F X R ( - 5 4 4 一+ 4 6 ) . 所含启动子 分别相应于 F X R基因序列的 一 1 6 5 1 一十2 0 0 , 一1 4 9 6一+2 0 0 , 一8 4 7一 +2 0 0 , 一5 4 4 +2 0 0 , 一 5 4 4 一+ 4 6 . 采用P
20、C R 方法从人基因组中获得不同 长度 F X R基因5 端片段. 引物根据人基因组碱基组 成设计, 并为上下游引物的5 端分别引人峥n 1 和 H i n d 1 I 酶切位点. 扩增片段用K p n 工 和H i n d II I 双酶 切后, 连接到同样被这两种酶酶切的p G L 3 b a s ic 载 体中的多克隆位点内, 构建含 F X R基因5 调控序列 和虫荧光素酶报告基因的重组质粒. 重组质粒经酶 切和测序进一步鉴定, 构建的重组质粒和相对应的 引物见 T a b l e 1 . T a b l e 1 T h e p r i m e r s e q u e n c e s
21、f o r r e p o r t e r p l a s m i d c o n s t r u c t s F r a g m e n t o f a m p l i f i c a t i o n P r i m e r s e q u e n c e 一 1 6 5 1十2 0 0 F l : 5 - G G C G G T A C C T G G A G G A T G C A C C A T A - 3 R 1 : 5 一 C T G A A G C T T C A A G G C C C T G G K p n I H i n d 班 G A GG A - 3 一1 4 9 6
22、+2 0 0 F 2: 5 - G G C G G T A C C G G G A A G TT G T K p n I T T C T C A - 3 R 2.- t h e s a me a s R1H i n d 1 8 4 7一 十2 0 0 F 3 : 5 - T T C G G T A C C G T G C C T A G C A A G T T GC T - 3 R 3: t h e s a me a s RI K p n I H i n d 1 一 十2 0 0 F 4 : 5 - G G C G G T A C C G G G T T G G A A AT A AG AG
23、- 3 K p n I R 4:t h e s a me a s RI 一5 4 4一 +4 6 F 5: t h e s a me a s F 4 R 5 5 一 C C G A A G C T T A G A C A A T G A G G T G AG G - 3 H i n d I K p n 工 H i n d m 1 . 5 瞬时转染 质粒转染按L i p o f e c t i a m i n e 2 0 0 0 使用说明进行. 转染前一天, 将H e p G 2 以1 x 1 0 5 / 孔接种至1 2 孔培 养板, 细胞生长至7 0 %一 8 0 %融合时, 加入1 p g
24、重 组质粒、 1 0 0 n g的 p s v (3 - g a l 及 4 p 1 L i p o f e c t ia m i n e 2 0 0 0 . 同时设立转染p G I 3 b a s i c 阴性对照组和p G L 3 c o n t r o l 阳性对照组. 1 . 6 荧光素酶报告基因活性检测 转染4 8 h 后, 每孔细胞加人2 0 0川1 x r e p o rt e r l y s i s , 离心收集上清 取2 0 l 上清用B i o - R a d 蛋白检 测试剂检测蛋白 含量. 每孔取1 0 p g 蛋白, 按照检测 试剂说明书操作, 用化学发光检测仪检测荧光
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