人嗜碱性粒细胞在不同刺激物作用下的组胺释放能力.pdf
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1、论著文章编号: 1007 -8738 (2005) 04 -0519 -03 人嗜碱性粒细胞在不同刺激物作用下的组胺释放能力 朱 薇1,何韶衡1*,林梓霞2,傅意玲1 (1汕头大学医学院变态反应学与炎症学研究所, 2汕头市中心医院麻醉科,广东 汕头 515031 = ) 收稿日期: 2004 -11 -24; 修回日期: 2005 -03 -28 作者简介:朱 薇 (1978 - ) ,女,江苏镇江人,硕士生. Tel: (0754)8900405;Email:shoahenghe hotmail. com *Corresponding author Histamine release pro
2、perties of human basophils in response to various stimuli ZHU Wei1,HE Shao-heng1*,LIN Zi-xia2,FU Yi-ling1 1Allergy and Inflammation Research Institute,Medical College, Shantou University, 2Department of Anaesthesiology, Shantou Central Hospital,Shantou 515031,China Abstract AIM:To investigate the ef
3、fects of protease activated receptor-2(PAR-2)agonist,heparin and other stimuIi on histamine reIease from human basophiIs. METH- ODS:PeripheraI bIood mononucIear ceIIs(PBMCs)were separated by density gradient centrifugation. The PBMCs were then resuspended in compIete Hank s baIanced saIt soIution(HB
4、SS)and chaIIenged with various stimuIating a- gents.Histamine IeveI in sampIes was determined by ELISA. RESULTS: 10 mg/ L trypsin couId induce histamine reIease from basophiIs. However,its stimuIatory effect on basophiIs was weaker than that of anti-IgE,caIcium iono- phore(CI) ,F-Met-Leu-Phe(FMLP) ,
5、C5a and substance P. PAR-2 agonist SLIGKV-NH2faiIed to activate basophiIs. Heparin,C5 and adenosine did not induce any histamine re- Iease at concentrations tested,but heparin enhanced hista- mine reIease induced by C5a and substance P. CONCLU- SION:Trypsin,anti-IgE,CI,FMLP,C5a and substance P can i
6、nduce histamine reIease from baosophiIs,but PAR-2 agonist can not. Heparin can greatIy enhance the abiIity of C5a and substance P to stimuIate histamine reIease,which may be a noveI mechanism of ampIification of basophiI acti- vation signaI. Keywords protease activated receptor-2;basophiI;hep- arin;
7、histamine 摘 要 目的:研究蛋白酶激活受体-2 (PAR-2) 激动剂和肝 素等,对嗜碱性粒细胞组胺释放的影响。方法:用 Ficoll 进行 密度梯度离心分离外周血单个核细胞 (PBMC) 。经 Hank s 平 衡盐溶液 (HBSS) 重新悬浮后进行嗜碱性粒细胞激发实验,用 酶联免疫试剂盒来检测组胺的水平。结果:浓度为 10 mg/ L 胰蛋白酶可引起嗜碱性粒细胞释放组胺,其作用强度较抗 IgE 抗体、钙离子载体 (CI) 及 P 物质等为弱。PAR-2 特异性 激动肽 SLIGKV-NH2对嗜碱性粒细胞没有明显的激活作用, 但抗 IgE 抗体、CI、F-Met-Leu-Phe (
8、FMLP) 、C5a 及 P 物质可 引起嗜碱性粒细胞显著的组胺释放。肝素、C5 和腺苷在试验 浓度内未引起组胺释放,但肝素可显著增加 C5a 和 P 物质诱 导的组胺释放。结论:胰蛋白酶、抗 IgE 抗体、CI、FMLP、 C5a 及 P 物质均可诱导嗜碱性粒细胞显著地释放组胺。PAR- 2 激动肽 SLIGKV-NH2不能引起组胺释放,肝素可增加 P 物 质和 C5a 引起的组胺释放,具有放大嗜碱性粒细胞激活信号 的作用。 关键词 蛋白酶激活受体-2;嗜碱性粒细胞;肝素;组织胺 中图分类号 R392. 12 文献标识码 A 嗜碱性粒细胞和肥大细胞在变态反应中起着初 级效应细胞的作用,其被激
9、活后可释放组胺及细胞 因子等多种炎症介质参与变态反应的发生和发展, 因而其激活和稳定机制一直受到人们的关注 1。He 等 2, 3发现蛋白酶激活受体-2 (PAR-2) 参与了肥大细 胞的活化,以及其被激活后分泌的类胰蛋白酶通过 再激活其细胞膜上的 PAR-2 形成细胞激活的自我放 大机制。同时还对肝素在肥大细胞激活中的调节作 用进行了研究 4。嗜碱性粒细胞与肥大细胞在形态 与功能上有着诸多类似,但关于嗜碱性粒细胞上 PAR-2 的研究以及肝素对肥大细胞激活的调节作用 尚未见报道。最近,我们采用一种可靠的人外周血 细胞嗜碱性粒细胞体外激发系统,通过应用 PAR-2 的激动剂胰蛋白酶、PAR-2
10、 特异性激动肽 SLIGKV- NH2,以及近年来报道的几种能引起嗜碱性粒细胞脱 颗粒的物质与肝素联合应用,对健康人外周血中的 嗜碱性粒细胞进行激发,并通过测定多种刺激剂作 用下净组胺释放率探讨了嗜碱性粒细胞的激活特征。 1 材料和方法 1.1 材料 Ficoll 购自 Amersham 公司。磷酸盐缓冲 液 (PBS) 、牛血清白蛋白、胎牛血清及 Hank s 平衡 盐溶液 (Hank s balanced salt solution,HBSS) 购自 Gibco 公司。钙离子载体 (CI) 、山羊抗人 IgE 抗体、 C5、C5a、P 物质、胰蛋白酶、F-Met-Leu-Phe (FMLP
11、) 915ISSN1007 -8738 细胞与分子免疫学杂志 (Chin J Cell Mol Immunol) 2005, 21 (4) 及腺苷和肝素,均为 Sigma 公司产品。PAR-2 激动肽 SLIGKV-NH2和反 PAR-2 激动肽 VKGILS-NH2,由西 安美联公司合成。组胺酶联免疫试剂盒购自 Beck- man Coulter 公司。 1. 2 方法 1. 2. 1 分离纯化人外周血嗜碱性粒细胞 将100 mL 抗凝健康人的外周血用等体积的 PBS 稀释后,用注 射器缓慢抽取并注入装有 Ficoll 的离心管中;两者的 体积比为 2: 1。于 20 以 500 g 无制动
12、、匀速离心 30 min,吸出单核细胞、淋巴细胞层即为 PBMC,用 含 20 mL/ L 胎牛血清的 HBSS 调至 50 mL,混匀以 2 000 r/ min 离心6 min,重复两次。冲洗后的细胞重 新悬浮于 10 mL HBSS 中,待激发用。 1. 2. 2 PBMC 中嗜碱性粒细胞和其他白细胞的鉴定 嗜碱性粒细胞的染色参考肥大细胞染色方法 5, 取10 L PBMC 悬液与20 L 阿辛蓝染料混合,于室 温下染色 20 min 后计数。着色的嗜碱性粒细胞镜下 呈天蓝色。同时取 PBMC 悬液 10 L 经细胞离心制 片后采用刘氏染色并进行细胞分类计数 6。 1. 2. 3 外周血
13、嗜碱性粒细胞的激发实验 详细方法 参考肥大细胞的激发实验 7。在冰上依照实验目的 加相应的试剂于各激发管中。将分离好的嗜碱性粒 细胞于 37水浴箱中预培养 5 min 后,向各个激发 管中加入 100 L 的细胞悬液,再于 37水浴箱中反 应 20 min。在冰上向每管中加入 150 L 冷的 HBSS 终止反应后于 4,以 2 000 r/ min 离心 10 min。取 上清转移至 1. 5 L 的管中,置 -20冻存。组胺的 总释放量是将试管中的细胞悬液煮沸 6 min,于冰上 降温离心后取其上清而获得。以相同的实验方案重 复 5 次,每个样品测定 2 次取其均值。 1. 2. 4 组胺
14、释放率的测定 采用酶联免疫试剂盒进 行检测。100 L 的标准品、对照品 (标准品和对照品 为该试剂盒附带) 或样品 (即实验所得上清) 与 50 L 的乙酰化溶液混匀后,取 50 L 乙酰化后的标准品、 对照品或标本,加入到已包被组胺抗体的 96 孔板 内,再于每孔内加入 200 L 碱性磷酸酶标物室温条 件下培养 2 h。洗板后加 200 L 底物液显色,然后 用酶标仪于波长 405 nm 测定吸光度 (A) 值。组胺的 释放以净释放率表示: 组胺的净释放率 = (组胺的释放量 - 自发组胺释放量) / 总组胺释放量100%。 1. 2. 5 统计学分析 全部结果均采用 SPSS (11.
15、 0 版) 软件分析。数据以 x s 表示。组间数据的比较 采用 t 检验,P 0. 05 者即具有显著性差异。 2 结果 2. 1 PBMC 中白细胞的种类及其比例 按血细胞形 态学标准分类计数,PBMC 中主要有淋巴细胞、单核 细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞和少量嗜酸性粒细 胞等,分别占 (62. 5 7. 1) %、 (25. 0 4. 9) %、 (7. 6 3. 1) %、 (3. 8 1. 7) %和 (1. 1 0. 8) %。 2. 2 各种刺激剂对组胺释放的诱导作用 浓度为 0.1 mg/ L 和 1. 0 mg/ L 的胰蛋白酶没有激活嗜碱性 粒细胞的作用,当将胰蛋白酶的浓
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