人微小病毒B19感染与KIKUCHI病的相关性.pdf
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1、研究原著文章编号: 1000-2790 (2006) 05-0475-04 人微小病毒 B19 感染与 Kikuchi 病的相关性 张伟平1, 黄高昇1, 王娟红1, 王文清1, 王 哲1, 胡沛臻1, 张 伟2 (第四军医大学: 1 西京医院病理科, 陕西 西安 710033, 2 唐都医院病理科, 陕西 西安 710038 = ) 收稿日期: 2005-07-12; 接受日期: 2005-09-23 通讯作者: 黄高昇. Tel:(029) 84774946 Email: huanggs fmmu. edu. cn 作者简介: 张伟平. 博士生 (导师黄高昇) , 主治医师. Tel:(0
2、29) 84774541 Email: weiping-zhang hotmail. com Relationship between human parvovir- us B19 infection and Kikuchi-Fujimoto disease ZHANG Wei-Ping1,HUANG Gao-Sheng1,WANG Juan-Hong1, WANG Wen-Qing1,WANG Zhe1,HU Pei-Zhen1,ZHANG Wei2 1Department of Pathology,Xijing Hospital,Fourth Military Medi- cal Univ
3、ersity,Xian 710033,China, 2Department of Pathology, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710038,China 【Abstract】AIM:To explore the relationship between parvovirus B19 infection and idiopathic Kikuchi-Fujimoto disease(KFD) . METHODS:Tissue blocks from lymph nodes of 32 idiopathic
4、 KFD patients and from normal lymph nodes of 13 normal controls were detected for parvovirus B19 DNA and viral proteins by in situ hybridization and immunohistochemical techniques in a double- blind manner.In situ hybridization and immunohistochemical double-staining were used to determine the type
5、of virus-infected cells. RESULTS:In situ hybridization and immunohistochemis- try revealed that the positive rates of B19 DNA and viral proteins were 71. 9% and 59. 4% respectively in the 32 idiopathic KFD patients. In the control group,the positive rates were 30. 8% and 23. 1%,respectively. Statist
6、ical analysis indicated that the posi- tive rates of B19 DNA and proteins differed significantly between the idiopathic KFD patients and the controls (P =0. 011 and P = 0. 027 respectively) . The B19 virus-infected cells were mainly lymphocytes and a small number of histocytes. CONCLUSION: Lymph nod
7、es from idiopathic KFD patients have higher parvovirus B19 infection rates than those from controls.Parvovirus B19 infection may play an important role in the pathogenesis of idio- pathic KFD. 【Keywords】 histiocytic necrotizing lymphadenitis;parvovirus B19;in situ hybridization;immunohistochemistry
8、【摘 要】目的: 研究人微小病毒 B19 感染与组织细胞性坏死 性淋巴结炎 (KFD) 的相关性. 方法: 采用双盲法在 32 例 KFD 患者及 13 例正常对照淋巴结活检组织中用原位杂交和免疫 组织化学染色方法检测 B19 病毒基因组 DNA 和病毒蛋白. 并采用原位杂交和免疫组化双标记法确定病毒感染的细胞类 型. 结果: 在 32 例 KFD 患者淋巴结中, B19 病毒 DNA 和病毒 蛋白阳性率分别为 71. 9% 和 59. 4%, 而在对照淋巴结中, 二 者阳性率分别为30. 8%和23. 1%. 统计学分析显示 B19 病毒 基因组 DNA 和病毒蛋白在 KFD 中有更高感染率
9、 (P 值分别 为 0. 011 和 0. 027) . 病毒感染的细胞大部分为淋巴细胞, 少 数组织细胞也是病毒感染的靶细胞. 结论: 微小病毒 B19 在 KFD 中有更高的感染率, 微小病毒 B19 与 KFD 的发病有密切 关系. 【关键词】组织细胞性坏死性淋巴结炎; 微小病毒 B19; 原位 杂交; 免疫组织化学 【中图号】R393. 1 【文献标识码】A 0 引言 组织细胞性坏死性淋巴结炎 (Kikuchi-Fujimoto Disease,KFD) 由 Kikuchi 和 Fujimoto 于 1970 年首先 报道. 是一种主要累及淋巴结的自限性全身性疾病, 世界各地均有报道,
10、 但以东方青年女性多见. 其病理 特征主要为淋巴组织散在灶片状坏死, 伴有大量组织 细胞浸润, 易与淋巴瘤混淆, 病因尚不清楚. 曾有研 究者发现在系统性红斑狼疮和嗜血细胞综合症伴发 KFD 样 淋 巴 结 改 变 患 者 中 检 测 到 人 微 小 病 毒 B19 1 -2, 但对于 B19 病毒与原发性 KFD 的关系, 仅 Chiu 等 3用免疫组化的方法检测了 10 例 KFD 患者 的淋巴结活检标本, 但未得到阳性结果. 在此, 我们 观察了人微小病毒 B19 基因组 DNA 及病毒衣壳蛋白 在原发性 KFD 中的表达情况, 以探讨二者的关系. 1 材料和方法 1. 1 材料 KFD
11、 组织活检标本 32 (男 11, 女 21) 例 来源于第四军医大学西京医院及唐都医院病理科, 均 经 HE 及 CD68 免疫化学染色并结合临床表现确诊 (图 1) . 患者年龄 10 69 (中位年龄 25) 岁. 31 例 (97%) 来源于颈部淋巴结; 16 例 (50%) 发病时有发 热. 所有患者均无皮疹、 关节炎等症状, 自身抗体阴 性. 同时, 以 13 例乳腺癌或胃癌患者未转移的淋巴 结做为标本对照. 所有活检标本均经常规固定, 石蜡 574 第四军医大学学报 (J Fourth Mil Med Univ) 2006; 27 (5) http: / / journal. f
12、mmu. edu. cn 包埋. 实验过程及结果观察均采用双盲法. 地高辛 标记及检测试剂盒 (Roche 公司) ;Taq DNA 聚合酶 和 dNTP (TaKaRa 公司) ; 鼠抗微小病毒 B19 衣壳蛋 白 VP1/ VP2 mAb (英国 Novocastra 公司) ; CD68 mAb (DAKO 公司) ; 染色 Histostain-SAP 试剂盒 (北京中 山 分 装, 德 国 Zymed 公 司) ;显 色 用 NBT/ BCIP (Roche 公司) . 图 1 组织细胞性坏死性淋巴结炎 HE 200 1. 2 方法 1. 2. 1 探针的制备 以 PCR 扩增所得
13、173 bp 大小 的 B19 病毒基因组 DNA 片段 (对应于病毒基因组序 列的3400 3572 bp) , 经测序验证后作为标记探针的 模板. PCR 引物依据文献 4 由上海生工生物工程 合成, 所用标记方法依据试剂盒说明书. 1. 2. 2 原位杂交 操作方法依据说明书及文献 5 . 石蜡切片经二甲苯脱蜡, 逐级乙醇脱水, 0. 2 mol/ L 盐酸酸化10 min, 0. 01 g/ L 蛋白酶 K 37消化 10 min. 0. 01 mol/ L PBS 洗后逐级乙醇脱水, 空气干 燥. 预杂交 30 min 后每张切片加 15 L B19 特异性 探针, 95变性 10
14、min, 聚冷10 min 后于湿盒中42 过夜. 逐级 2 SSC, 1 SSC, 0. 5 SSC, 0. 2 SSC, 0. 1 SSC 振洗. 封闭缓冲液 37封闭 30 min, 加入 碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体置 37, 3 h. Wash- ing 缓冲液振洗 30 min, 加入 NBT/ BCIP 混合物避光 显色. 观察到明确阳性信号后终止显色, 脱水、 透明、 中性树胶封片. 以预杂交液和标记试剂盒所带标记 上地高辛的质粒 pBR328 线性 DNA 做为阴性对照. 1. 2. 3 免疫组织化学 组织片经梯度乙醇脱蜡至 水, 经 3 mL/ L 过氧化氢甲醇封闭内源性过
15、氧化物 酶、 100 g/ L BSA 封闭非特异性结合位点后, 加入 B19 特异性 mAb 4过夜. 第 2 日切片经 37复温、 PBS 洗后加入生物素化二抗于 37孵育 20 min, PBS 洗, 加入碱性磷酸酶标记的抗生物素复合物, 37 孵育 20 min, PBS 洗后加入 NBT/ BCIP 避光显色. 阳性信 号出现后终止显色, 脱水、 透明、 中性树胶封片. 染色 中以相同 Ig 浓度抗人神经胶质酸性蛋白抗体 (与 B19 抗体同属 IgG G1 亚类) 和 PBS 分别做替换对照 和阴性对照. 1.2. 4 原位杂交 - 免疫组化双标记 免疫组化依上 述方法进行. 10
16、0 g/ L BSA 封闭非特异性结合位点 后, 高压修复抗原表位. 加入抗人组织细胞单抗表面 标记 CD68 mAb 于37孵育2 h, PBS 洗, 加入生物素 化二抗, 37孵育 20 min, PBS 洗, 加入标记过氧化物 酶标记的抗生物素复合物, 37 孵育 20 min, PBS 洗 后加入 DAB 显色. 阳性信号出现后终止显色, 进入 原位杂交染色程序, 方法同前述. 满意阳性信号出现 后切片脱水、 透明、 中性树胶封片. 统计学处理: B19 病毒原位杂交及免疫组化阳性 例数在两组中分别以阳性率表示, 两组之间差别做 x2检验, 用 SPSS 11. 0 软件完成. P 0
17、. 05 表示差别 有统计学意义. 2 结果 2.1 原位杂交 B19 特异性探针原位杂交阳性信号 位于细胞核中, 阳性细胞主要分布于滤泡间区, 在坏 死区及生发中心只有少量散在阳性细胞 (图 2) . 图 2 组织细胞性坏死性淋巴结炎 B19 特异性探针原位杂交 NBT/ BCIP 400 2. 2 免疫组织化学 病毒蛋白既存在于胞质, 也存 在于胞核中, 且在所有阳性组织中均可见到此种分 布, 但在某一阳性病例中以胞质或胞核中的一种分布 为主 (图 3) . 2. 3 原位杂交 - 免疫组化双标记 大量 B19 特异 性探针杂交阳性细胞 CD68 抗体染色阴性, 只有少数 组织细胞原位杂交
18、信号阳性 (图 4) . 表明 B19 感染 细胞主要为淋巴细胞, 少量为组织细胞. 经原位杂交 674 第四军医大学学报 (J Fourth Mil Med Univ) 2006; 27 (5) http: / / journal. fmmu. edu. cn 和免疫组化检出的 KFD 组 B19 病毒基因组 DNA 和 病毒蛋白阳性率见表1, 经 x2检验分析两组差别明显 (P 0. 05) , 即 KFD 组人微小病毒 B19 感染率明显 高于对照组. 阳性信号在胞核 (粗箭头) 和胞质 (细箭头) 中均可看到, 但本例以胞 核为主. 图 3 B19 特异性抗体免疫组化染色结果 NBT/
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