《人源抗肝癌单链抗体库的构建及初步鉴定.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《人源抗肝癌单链抗体库的构建及初步鉴定.pdf(3页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、收稿日期: ! “ “ # - “ - 修回日期:! “ “ # - “ * - ! ! 基金项目: 湖北省卫生厅科研基金资助项目(J X S i n g l ec h a i na n t i b o d y;H e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a 摘 要: 目的 构建人源抗肝癌单链抗体基因噬菌体表面呈现文库。方法 利用噬菌体表面呈现技术, 构建基因文库, 经过p a n n i n g筛选富集后, 用E L I S A方法检验抗原结合活性。结果 从$ “个噬菌体克 隆中筛选到)个具有肝癌细胞株S MMC % % ! 单链抗体; 肝癌 中图分
2、类号:R % $ #. %;R % $ - $ 文献标识码:A 文章编号: # #, ! m i n;% !,! m i n; 共$ “个循环。% !延伸 * $, m i n; 共%个循环。用S f i 、N o t 限制性内 切酶切割上 述S c F vP C R产物, 与相应双酶切的 p C ANTA B - # E载体片段用TD NA连接酶连接。 &. !. # S c F v基因噬菌体呈现文库的构建 取连接 产物转化感受态E. c o l iT G &, 于S O B AG琼脂板上 过夜, 筛选出转化菌落, 用!+YT-AG稀释培养细 菌悬 液 至A* “ “ n m =“. $,$
3、 %震 荡 培 养,加 入 M & $ k “ %, 离心后于!+YT-AK中过夜, 离心收集 上清, 即为抗人肝癌单链抗体库。 &. !. * 噬 菌 体 抗 体 库 的 筛 选 在 上 清 中 加 入 P E G/N a C l, 取含叠氮钠的封闭液稀释P E G沉淀的 重组噬菌体, 室温下孵育, 加入S MMC % % ! &细胞抗 原包被的锥形培养瓶 中 孵育。P B S、P B S T洗瓶。 将对数生长期的E. c o l iT G &加入上述免疫吸附后 的培养瓶内孵育。移至# “ m l细菌培养管中, 再加 入M & $ K “ %, $ %震荡培养, 共轮富集筛选。 &. !.
4、% 噬菌体抗体库抗体特异性测定 将富集的 重组菌涂平皿, 从中挑选$ “株单克隆菌株。均加入 辅助噬菌体超感染后, 置于!+YT - AG中过夜。接 种适量S MMC % % ! &细胞于( *孔培养板中, 待细胞 长满孔底后, 用“. & ! #%戊二醛室温固定& “ m i n, 以 $%B S A封闭非特异结合部位。每孔加上述噬菌体 抗体# “ l, 经“. “ #% T w e e n ! “ - P B S洗涤后, 加辣根 过氧化物酶标记的抗M & $抗体进行结合反应, $ % 温育& h,P B S洗板#次,A B T S显色。以M & $ KO % 为阴性对照, 测定孔E L I
5、 S A O D值为阴性孔!$ 倍者为阳性。 2 结果 !. & VH、V L的扩增和鉴定 扩增产物在&. #%琼 脂糖 凝 胶 中 电 泳, 扩 增 出 的VH基 因 片 段 应 为 $ “ b p,V L基因片段为$ ! # b p, 实验结果与预期结果 相符,见图&。 !. ! S c F v基因的拼接、 扩增和鉴定 扩增产物在 &. #%琼脂糖凝胶中电泳应得到一条约% # “ b p的 S c F v片段, 实验结果与预期结果相符, 见图!。 !. $ 噬菌体抗体库的筛选 经对噬菌体抗体库进 行轮“ 吸附-洗脱-扩增” 的富集筛选, 测定噬菌 图1 全套V H、V L基因的扩增 图2
6、S c F v基因的扩增 体滴度, 计算每一轮筛选后噬菌体的收获率, 噬菌体 收获率由第&轮的*. *+& “ -(% 增到第轮的&. % +& “ -*%, 共增加了! # %倍。 !. P a n n i n g筛选及抗原结合活性鉴定 从第 轮筛选后得到的细菌集落中随机挑选$ “个克隆, 用 E L I S A测定上清液中噬菌体抗体与S MMC % % ! &细 胞结合活性。加入H!O ! -A B T S后, 阳性克隆孔中 液体变为绿色, 阴性孔中液体不变色。显色后, 阴性 对照孔A & “ n m值为“. “ (, 有)株E L I S A的O D值 较高, 呈现阳性反应, 其A &
7、“ n m值分布于“. ! # “. # &之间, 阳性克隆检出率约为! %。 3 讨论 部分单克隆抗体, 如治疗乳腺癌的抗体H e r - c e p t i n已进入临床应用中, 还有数种抗体也处于临 床前实验阶段 #。然而, 由于目前制备的单克隆抗 体绝大多数为鼠源性的, 对人体有较强的免疫源性, 在临床治疗中易引起人抗鼠抗体(HAMA) 反应, 且 其分子量大, 血管通透性差, 注入人体后在肿瘤部位 的积聚量少, 给临床应用带来了一定的困难 *。而 用噬菌体抗体展示技术, 不经免疫途径而直接从外 周血淋巴细胞中获取可变区基因, 经R T - P C R扩增 出整套的S c F v基因片
8、段, 重组于噬菌体中, 形成含 有全套抗体谱( r e p e r t o i r e) 的噬菌体抗体库, 再利用 87 肿瘤防治研究! “ “ *年第$ $卷第!期 抗原-抗体特异性结合进行筛选、 富集, 并扩增所需 克隆。将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒 颗粒内, 在大肠杆菌中稳定高效表达, 所获得的人源 性抗体的免疫源性明显减弱,使其临床应用成为可 能 %。 本文从肝癌患者外周血淋巴细胞中抽提R NA, 经R T - P C R, 并采用噬菌体抗体库技术, 构建了抗人 肝癌全套单链抗体基因文库, 从$ “个克隆中筛选出 )个具有抗原结合性的抗体片段。属全人源性抗 体, 避免了鼠源性
9、抗体所需的人源化等下游工程。 在具体的筛选过程中, 通常采用纯化抗原包被培养 板或在肿瘤细胞表面筛选初级抗体库。本研究中采 用S MMC % % ! &细胞抗原包板, 对抗体库进行亲和筛 选。经过几轮吸附-洗脱-扩增的P a n n i n g过程, 富集到含特异性抗体片段的噬菌体, 筛选到目的克 隆。不仅可省去了纯化抗原的繁琐操作, 而且有利 于保持靶抗原的天然构象。我们认为, 这样所获得 的抗体能确保与天然状态下的膜表面抗原结合, 确 保了抗体今后的应用潜力 )。此外, 抗原竞争洗脱 法还避免了常用的酸洗脱法对噬菌体活性的影响, 有利于下一轮扩增。用噬菌体抗体展示技术筛选到 的抗体其亲合力
10、与抗体库容量成正相关, 载体的转 化效率是制约抗体库容量的主要因素 (, 为此我们 使用转化率高的电穿孔法进行转化, 并增加转化次 数以累积库容。 目前, 我们已利用噬菌体表面呈现技术构建人 源肝癌单链抗体基因库, 初步鉴定显示抗体针对肝 癌细胞株的亲和活性, 为提高S c F v的稳定性, 评价 其免疫原性等进一研究打下基础。 参考文献: & 吴孟超.原发性肝癌外科综合治疗的现状和展望J.中华外 科杂志,! “ “ , !(&) :& $ - & #. ! S i e g e l &RW,A l l e n &B,P a v l i kP,e t a l .M a s s s p e c t
11、 r a l a n a l y s i s o f ap r o t e i nc o m p l e xu s i n gs i n g l e - c h a i na n t i b o d i e s s e l e c t e do na p e p t i d e t a r g e t:a p p l i c a t i o n s t o f u n c t i o n a l g e n o m i c sJ.M o l B i - o l,! “ “ “,$ “ !(!) :! ) # - ! ( $. $ C h a nKT,C h e n gS C S,X i eH,
12、e t a l . Ah u m a n i z e dm o n o c l o n a l a n t i b o d yc o n s t r u c t e d f r o mi n t r o n l e s s e x p r e s s i o nv e c t o r s t a r g e t s h u m a nh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m ac e l l sJ.B i o c h e m B i o p h y s R e sC o mm u n,! “ “ &,! ) (&) :& # % - & * %. 梁
13、国栋.最新分子生物学实验技术M.第&版.北京:科学出 版社,! “ “ &. ) - ) %. # A z e m a rM,D j a h a n s o u z i S,J a g e rE,e t a l . R e g r e s s i o no f c u t a - n e o u st u m o r l e s i o n s i np a t i e n t s i n t r a t u m o r a l l yi n j e c t e dw i t ha r e c o m b i n a n ts i n g l e - c h a i na n t i b o
14、d y - t o x i nt a r g e t e dt o E r b B !/ HE R !J. B r e a s tC a n c e rR e sT r e a t,! “ “ $,) !($) :& # # - & * . * S c o t tAM,W e l tS.A n t i b o d y - b a s e di mm u n o l o g i c a lt h e r a p i e s J. C u r rO p i nI mm u n o l,& ( ( %,(#) :% & % - % ! !. % A z z a z yHME,H i g h s m
15、i t hWE. P h a g ed i s p l a yt e c h n o l o g y:c l i - n i c a la p p l i c a t i o n sa n dr e c e n ti n n o v a t i o n sJ.C l i nB i o c h e m, ! “ “ !,$ #(*) : ! # - #. ) 朱建高, 李官成, 李跃辉, 等.全人源化抗结肠癌单链抗体基因 的克隆和表达J.生物工程学报,! “ “ &,& %(#) :# ! * - # $ “. ( H o n gS H,L e eM S,P a r kS,e ta l .Ap h a g e m i ds y s t e me n a b - l i n ge a s ye s t i m a t i o no ft h ec o m b i n a t o r i a la n t i b o d yl i b r a r ys i z e J. I mm u n o lL e t t,! “ “ ,( &(! - $) :! % - ! # $. 编辑:贺 文 97 肿瘤防治研究! “ “ *年第$ $卷第!期
链接地址:https://www.31doc.com/p-3698951.html