人源抗狂犬病毒二硫键稳定性FV抗体片段基因的构建与表达.pdf
《人源抗狂犬病毒二硫键稳定性FV抗体片段基因的构建与表达.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《人源抗狂犬病毒二硫键稳定性FV抗体片段基因的构建与表达.pdf(4页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、人源抗狂犬病毒二硫键稳定性F v抗体片段基因的构建与表达 赵小玲 荫俊 陈伟强 杨冠 张素娟 摘 要 目的 构建人源抗狂犬病毒二硫键稳定性F v(d s F v) 抗体基因, 并在原核系统中实现高效表达, 制备有活性的人源抗狂 犬病毒d s F v抗体片段。方法 采用P C R定点突变的方法, 构建抗狂犬病毒d s F v抗体的重、 轻链(VH、V L) 突变基因,N d e和N o t 双酶切后分别插入p E T - 2 2 b(+) 表达质粒中, 转化E. c o l iB L 2 1(D E 3) ,I P T G诱导表达。将V L、VH包涵体蛋白经盐酸胍变性, 按比例 混合在复性折叠缓
2、冲液中, 使二者折叠形成d s F v抗体片段。并以其母本抗体s c F v作对照, 对其抗原特异性和稳定性进行初步评价。 结果 在VH的第4 4位氨基酸和V L的第1 0 0位氨基酸引入了半胱氨酸, 成功构建了抗狂犬病毒d s F v抗体基因, 并在原核系统中实 现了对二者的高效表达,VH、V L蛋白在复性缓冲液中正确折叠形成了d s F v抗体片段。结论 对筛选获得的抗狂犬病毒s c F v成功 进行了稳定性改构, 制备了有活性的d s F v抗体片段, 改构以后的d s F v保持了对狂犬病毒的特异结合活性, 而其在血清中的稳定性有 明显改进, 而且其热稳定性和抵抗尿素化学变性的能力亦大
3、大改进。 关键词 狂犬病病毒; 二硫键稳定性F v抗体; 基因表达 中国图书资料分类号 Q 7 8 C o n s t r u c t i o na n de x p r e s s i o no f h u m a nd i s u l f i d e - s t a b i l i z e dF v f r a g m e n t g e n e t oR a b i e sV i r u s Z h a oX i a o l i n g,Y i n J u n,C h e nW e i q i a n ge t a l. C e n t e r f o rM i c r o b i a
4、l D e t e c t i o n a n dR e s e a r c h ,I n s t i t u t e o fM i c r o b i - o l o g ya n dE p i d e m i o l o g y,A c a d e m yo fM i l i t a r yM e d i c a l S c i e n c e,B e i j i n g1 0 0 0 7 1,C h i n a A b s t r a c t O b j e c t i v e T or e a l i z e t h e c o n s t r u c t i o na n de x
5、p r e s s i o no fh u m a nd s F vg e n e s t or a b i e sv i r u s .M e t h o d s T h eg e n e so fd s F v VHa n dV Lw e r e a m p l i f i e db yP C R - b a s e dp o i n tm u t a g e n e s i ss t r a t e g y . T h e nt h eg e n e sw e r ec l o n e d i n t op l a s m i dp E T - 2 2 b(+). E. c o l i
6、B L 2 1(D E 3)w a s t r a n s f o r m e dw i t ht h e r e c o m b i n a n t e x p r e s s i o np l a s m i da n d t h ep r o t e i nw a s i n d u c e d i nL u r i s - B e r t a n im e d i u mb ya d d i t i o no f I P T G. T h e i n c l u s i o nb o d yp r o t e i n s o fVHa n dV Lw e r e d e n a t u
7、 r a l i z e db yG u H C l,a n d t h e n r e - n a t u r a l i z e d i n r e f o l d i n g s o l u t i o n t o f o r md s F v f r a g m e n t s . A f t e r w a r d s,w e e v a l u a t e d t h e a n t i g e n - b i n d i n g a c t i v i t y o f t h e d s F v a n d i t s s t a b i l i t y a s c o m p
8、a r e dw i t h i t s o r i g i n a t i v e s c F v . R e s u l t s T h e f r a g m e n t g e n e so f d s F v t or a b i e sv i r u sw e r ec o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l yb yP C R - b a s e dp o i n tm u t a g e n e s i ss t r a t e g y . S e q u e n c ea n a l y s i s p r o v e d t h a
9、 t c y s t e i n e sw e r e i n t r o d u c e d i n t o t h ep o s i t i o n4 4a ao fVHa n dp o s i t i o n1 0 0a ao fV L. T h ed s F vVHa n dV Lg e n e sw e r ee x - p r e s s e d i nP E T 2 2 b(+) /B L 2 1(D E 3). T h eVHa n dV Lp r o t e i n f o l d e d i n t o t h e a c t i v e d s F v a n t i b
10、 o d y f r a g m e n t sw h i c hs h o w e d s p e c i f i cb i n d - i n gc a p a b i l i t y t or a b i e sv i r u s . C o n c l u s i o n W e s u c c e e d e d i na c h i e v i n g t h e s t a b i l i z a t i o no f t h eh u m a ns c F vt or a b i e sv i r u sa n do b t a i n i n gt h e a c t i v
11、 eh u m a nd s F va n t i b o d y f r a g m e n t s . T h i s e s t a b l i s h e da s o l i db a s i s f o r f u r t h e r s t u d yo f t h eb i o l o g i c a l a c t i v a t ya n dc l i n i c a l a p p l i c a t i o no f d s F v t or a b i e sv i r u s . K e yw o r d s r a b i e sv i r u s;d i s u
12、 l f i d e - s t a b i l i z e dF v f r a g m e n t;g e n e e x p r e s s i o n 经抗体库技术筛选获得的抗狂犬病毒s c F v的抗 原特异性和亲和力均较好, 但稳定性不理想, 容易解离 形成多聚物沉淀 1。因此本研究采用通用突变位点: VH 4 4/V L 1 0 0, 应用P C R定点突变的方法, 构建抗狂犬 病毒 二 硫 键 稳 定 性F v( d i s u l f i d e - s t a b i l i z e dF vf r a g - m e n t s,d s F v) 轻、 重链的突变基因,
13、并分别在大肠杆菌 中进行了表达, 二者经共同复性, 表达蛋白正确折叠形 成了特异性d s F v蛋白, 为其后面的生物学活性研究及 临床应用奠定了基础。 1 材料与方法 1 . 1 材料 模板质粒是携带人源抗狂犬病毒s c F v基 因的重组噬菌粒克隆载体, 筛选制备见文献 1 ; 抗狂 犬病毒s c F v抗体片段的制备见文献 2 ; 狂犬病毒P M 株V e r o疫苗为法国维尔博公司产品; 表达质粒p E T - 2 2 b(+) 购自N o v a g e n公司。 1 . 2 引物设计与合成 为将噬菌粒中s c F v基因突变 成d s F vVH、 V L基因, 设计了如下引物:
14、扩增d s F vVH基因的5 端引物序列如下:H 1, 5 - T G C C T G G A G T G G G T C T C G G G T - 3 ( 划线处为突变位 点) ;H 2,5 - C A G G C T C T G G A T T C A C T T T A G A T G A T - T A T G C C A T G C A C T G G G T C C G C C A A T T T C C T G G G A - A G T T G C C T G G A G T G G G T C T C G - 3 ( 划线处为突变位 点) ;H 3,5 - G C G G
15、 A A T TC A T A T GC A G G T G C A G C T - G C A G G A G T C G G G G G G A G G C G T G G T G C A G C C T G G - C A G G T C C C T G A G A C T C T C C T G T G C A G G C T C T G G A T T C A C C - 3 ( 划线处为N d eI酶切位点) 。扩增d s F v VH基因的3 端引物序列如下:H D:5 - G A G T C A T - T C T C G A C TT G C G G C C G C C C
16、T T G G T G G A G(A)G C 作者简介: 赵小玲, 助理研究员。主要从事微生物及基因工程抗体的研 究。已发表论文6篇。E - m a i l:x l z h a o 9 8 5 s o h u . c o m 作者单位:1 0 0 0 7 1 北京 军事医学科学院微生物流行病研究所( 赵小 玲、 荫俊) ;天津军事医学科学院卫生学环境医学研究所( 赵小玲、 陈伟 强) ; 军事医学科学院生物工程研究所( 杨冠) ; 解放军第2 5 4医院( 张素 娟) 通信作者: 陈伟强, 电话:0 2 2 - 8 4 6 5 5 3 3 3;E - m a i l: t j c h e n
17、 w q s o h u . c o m 421 解放军医学杂志2 0 0 6年2月 第3 1卷 第2期M e dJC h i nP L AV o l 3 1N o2F e b r u a r y2 0 0 6 T G A G(A)G A G A C G G T G A C C - 3 ( 划线处为N o tI酶切 位点) 。 扩增d s F vV L基因的5 端引物序列如下:K V: 5 - G C G G A A T T C A T A T G G A C A G C C A G A G G A C C C A G T - C T C C - 3 ( 划线处为N d eI酶切位点) 。 扩
18、增d s F vV L基因的3 端引物序列如下:K 1: 5 - G C A G C C G A A C G T C G C A G - 3 ( 划线处为突变位点) ; K 2:5 - G A G T C A T T C T C G A C TT G C G G C C G C T G C A G - C C A C A G T A C G T T T G A T C T C C A C C T T G G T G C CG C A - 3 ( 划线处为N o tI酶切位点) 。 1 . 3 d s F vVH、V L突变基因的构建 采用P C R定点 突变方法。先分别用引物H 1与H D和K
19、 V与K 1以 带有s c F v基因的质粒为模板进行第一轮P C R分别制 备重链、 轻链突变基因: 质粒D N A5 n g, 引物H 1和H D 各0 . 4 g , p f u T a q 酶2 U, d N T P1 l,1 0b u f f e r5 l, 加 水至5 0 l。扩增条件:9 4 变性5 m i n, 然后9 4 1 m i n, 5 5 4 0 s,7 2 4 0 s,3 0个循环,7 2 3 m i n。P C R产物纯 化回收, 溶于5 0 lT E中。 再以上述纯化的P C R产物为模板进行第二次 P C R, 扩增引物分别为H 2与H D和K V与K 2,
20、扩增条 件同上。将P C R产物纯化回收。轻链采用第二次 P C R产物进行测序, 重链再以第二次纯化的P C R产物 为模板进行第三次P C R, 引物为H 3和H D, 扩增条件: 9 4 变性6 m i n, 然后9 4 2 m i n、5 5 1 m i n、7 2 1 m i n, 循环3 0次, 7 2 5 m i n, 采用第三次P C R产物进行测 序。 1 . 4 突变基因的序列测定 d s F vVH、 V L突变基因 的P C R产物用N d eI和N o tI分别进行双酶切, 于1 % 琼脂糖凝胶上电泳, 用P r o m e g a柱式回收法快速回收 酶切好的目的片段
21、, 分别与经同样双酶切回收好的 p E T 2 2 b(+) 载体用T 4连接酶连接, 转化E. c o l iB L 2 1 ( D E 3) , 提取质粒, 用T 7p r o m o t e r和T 7t e r m i n a t e r引 物进行双脱氧末端终止法测序, 检测突变效果。 1 . 5 d s F vVH和V L蛋白的表达 挑取阳性克隆接 种于2 m lL B培养液(A m p1 0 0 m g/m l) 中, 3 7 振摇过 夜。次日, 分别取3 0 l菌液转种于2 m lL B培养液 (A m p 1 0 0 m g/m l) 中, 3 7 振摇3 4 h至O D 6
22、0 0 = 0 . 6 1 . 0, 加I P T G至1 m m o l /L, 继续振摇3 h。诱导后菌液6 0 0 0 r/m i n离心1 0 m i n, 弃上清, 加1 0 0 l1上样缓冲 液, 9 5 水浴5 m i n,1 20 0 0 r/m i n离心1 m i n。取上清加 样于1 5 %S D S - P A G E电泳, 考马斯亮蓝染色, 脱色后观 察结果。S D S - P A G E凝胶以双薄层扫描仪检测蛋白表 达含量。 1 . 6 d s F vVH和V L包涵体蛋白的分离 5 0 m l菌液 按上述方法进行诱导表达, 60 0 0 r/m i n离心5 m
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 人源抗 狂犬病毒 二硫键 稳定性 FV 抗体 片段 基因 构建 表达
链接地址:https://www.31doc.com/p-3698956.html