人瘦素蛋白在大肠杆菌中的融合表达和纯化.pdf
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1、3 3 6 实 验 习干 究 人瘦素蛋白在大肠杆菌中的融合表达和 纯化 李文娟陈伟朱任之付小兵 【 摘 要】 目 的 构建人瘦素因 子( L e p t in ) 的 原核表达质粒p G E X - 4 T - 3 - L E P , 并诱 导该基因 在 原核细胞中大量表达。方法采用逆转录一 聚合酶链反应( R T - P C R ) 和D N A重组技术, 从人皮肤成 纤维细胞内 将编码人L e p t in 的c D N A序列克隆至原核表达载体p G E X - 4 T - 3 上, 选取阳性克隆扩增 后, 提取D N A进行酶切鉴定和测序。同时应用S D S - P A G E和蛋白质
2、印迹方法对其表达产物进行 特异性鉴定。 结果 克隆出的L e p t i n 基因的c D N A由4 6 9 b p 组成, 包 括翻译起始密 码子、 编码序列 和终止密码子等部分, 含有L e t i n p 基因的c D N A的表达质粒p G E X - 4 T - 3 在D H 5 。 细菌体内能够表 达, 并且随着诱导时间的延长, L e p t i n 基因的表达量增加, 重组L e p t i n 蛋白主要存在于包涵体中。 结论 L e p t i n 基因可以 在原核细胞中获 得表达, 为深入研究该蛋白 在创伤愈合中的具体作用莫定 了基础。 【 关键词】 L e p t i
3、n 基因; 原核表达载体;克隆 F u s io n e x p r e s s io n a n d p u r it y o f h u m a n le p t in in E . c o li L I W e n -j u a n , C H E N W e i , Z H 6 R e n - z h i , e t a l . * K e y R e s e a r c h L a b o r a t o r y o f W o u n d R e p a i r , 3 0 4 t h C l i n i c a l D e p a r t m e n t o f G e n e
4、r a l H o s p i t a l o f P L A, B e ij i n g 1 0 0 0 3 7 , C h i n a ( A b s t r a c t O b j e c t i v e T o c o n s t r u c t t h e p l a s m i d o f p G E X - 4 T - 3 - L E P f o r L e p t i n w it h p ro k a ry o t i c e x p r e s s i o n v e c t o r p G E X - 4 T - 3 a n d i n d u c e t h e L e
5、 p t i n p r o t e i n e x p r e s s i o n i n E . c o l i D H 5 a . Me t h o d s R T - P C R t e c h n o lo g y in v it ro w a s u s e d t o c lo n e c D N A ( c o m p le m e n ta ry d e o x y r ib o n u c le ic a c id ) s e q u e n c e c o d in g h u m a n l e p t i n . D N A r e c o m b i n a t i
6、 o n m e t h o d w a s a d o p t e d t o i n s e rt t h e s e q u e n c e i n t o t h e m u l t i p l e c l o n i n g s i t e s o f p G E X - 4 T - 3 . R e s u l ts T h e c D N A s e q u e n c e e n c o d i n g l e p t i n w a s c l o n e d in t o t h e p r o k a r y o t i c e x - p r e s s io n v e
7、 c t o r p G E X - 4 T - 3 t o c o n s t r u c t p G E X - 4 T - 3 - L E P . T h e s e q u e n c e o f c D N A w a s id e n t i c a l t o c o d i n g f r a m e w o r k o f l e p t i n g e n e , w h i c h w a s c o m p o s e d o f t r a n s l a t i n g o r i g i n a l c o d o n , c o d i n g s e q u
8、e n c e a n d t e r m i - n a t i n g c o d o n , C o n c l u s i o n T h e p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n p la s m id p G E X - 4 T - 3 - L E P w a s s u c c e s s f u l l y c o n - s t r u c t e d . F r o m t h e b a s i s o f t h e w o r k , f u rt h e r r e s e a r c h o f w o u n d h
9、 e e l i n g w i t h l e p t i n c o u l d b e c a r r ie d o u t . K e y w o r d s L e p t in g e n e ; P r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n v e c t o r ; C l o n e 瘦素( L e p t i n ) 是一种多功能的细胞因子, 与受体 特异性结合后, 诱导细胞内一系列信号传递, 最终导致 细胞核内特异的基因表达, 促进血管内皮细胞增殖, 加 速血管形成, 在创面愈合、 组织再生和糖尿病足溃疡治 疗过程中起重要的调节作用
10、1 , 2 1 。因此, 瘦素在创伤 修复, 组织重建和血管生成等领域具有广阔的临床应 用前景。本研究首先采用基因技术克隆出瘦素基因的 c D N A序列, 将其连接到高效表达载体中, 并诱导蛋白 表达, 为深入研究该蛋白的生物活性及其在创面愈合 中的作用奠定了基础。 材料与方法 基金项目: 国家自 然科学基金资助项目( 3 0 4 0 0 1 7 2 ) ; 国家9 7 3 计划 资 助项 目( 2 0 0 5 C B 5 2 2 6 0 3 ) ; 国家杰出青年科学基金资助项 目 ( 3 9 5 2 5 0 2 4 ) 作者单位: 1 0 0 0 3 7 北京, 解放军总医院3 0 4 临
11、床部全军创伤修复重 点实验室( 李文娟、 陈伟、 付小兵) ; 兰州大学基础医学院病理教研室( 朱 任之) 1主要材料: 限制性内切酶 B a r n H I , K p n I , T 4 D N A连接酶及多聚核普酸激酶为T a K a R a 公司产 品。其他如: 克隆质粒p G E M - T - E a s y , p f u T a g D N A聚 合酶, M R N A分离试剂盒、 逆转录( R T ) 试剂盒、 聚合酶 链反应( P C R ) 产物纯化试剂盒为P r o m e g a 公司产品。 T r i z o l 总R N A试剂盒( G i b c o ) 。硝酸
12、纤维素膜, We s t - e rn显色试剂盒, 兔抗人L e p t i n 多抗, 山羊抗鼠I g 二抗 为美国S a n t a 公司产品。细菌E . c o l i D H 5 + 、 表达载体 p G E X - 4 T - 3 和人原代成纤维细胞为本室保存。L e p t i n 基因的引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。 2 . 人原代成纤维细胞总R N A的提取: 按T r iz o l 试 剂盒所述方法提取处于分裂增生期的人皮肤原代成纤 维细胞 的总 R N A 。用无 R n a s e水溶解总 R N A , 一 2 0 保存备用。取少量总R N A在紫外分光光度计
13、 3 3 7 下定量, 同时进行甲醛变性凝胶电泳, 检测所提取总 R N A的质量, 具 体方法参照 3 0 3 . m R N A的分离、 逆转录、 扩增和测序: 取适量总 R N A , 遵循P o l y A T t r a c t ( m R N A I s o l a t i o n S y s t e m的操 作要求分离纯化m R N A后, 以O l i g o ( d T ) 为引物, 遵循 c D N A S y n t h e s i s S y s t e m操作步骤合成 d s c D N A 。以 d s c D N A 为模板, 以L e p t i n 基因的引物
14、进行P C R扩 增, 反应产物用1 . 4 % 琼脂糖凝胶电泳鉴定, 目的D N A 片段的胶条用 P C R产物纯化试剂盒回收。纯化的 D N A 片 段插入p G E M - T - E a s y 克隆载体中, 挑取阳 性 克隆在A B I 3 7 7 全自 动测序仪上进行序列分析。 4 . 重组质粒的 构建: 将 纯化括的P C R 产物和原核 表达载体p G E X - 4 T - 3 用限制性内切酶酶切后, 在 T 4 D N A连接酶作用下进行重组连接, 得到重组质粒 p G E X 4 T - 3 - L E P , 将 p G E X - 4 T - 3 - L E P转化
15、入菌株 D H 5 a , 培养至吸光度达0 . 6 左右时, 加入异丙基书 - D 一 硫 代半乳糖昔( I s o p r o p y - p - D - t h i o g a l a c t o s i d e , I P T G ) 至终 浓度为1 m m o l / L , 继续 3 7振荡培养 5 h 。收获菌 体, 悬浮于1 % T r i t o n X - 1 0 0 的T E中, 用超声波破碎 细胞, 离心收集上清, 沉淀依次用 8 %尿素洗涤溶解 后, 进行1 % S D S - P A G E电泳后, 用考马斯亮蓝染色。 5 . 包涵体的处理: 将 1 L菌液离心所得
16、到的菌体 重悬于3 0 m l 磷酸盐缓冲溶液( P B S ) 中, 加入5 m m o l / L 二硫苏糖醇( D T T ) , 冰浴中超声波破碎3 0 m i n , 低温 下1 8 0 0 0 r / m in 离心2 5 m i n 。弃上清, 用3 0 m l 包涵体 洗涤液( 3 0 %蔗糖, 1 0 0 m m o l / L N a C l , 5 0 m m o l / L T r i s , p H 8 . 0 , 0 . 5 % T r i t o n X - 1 0 0 ) 洗涤2 一 3 次, 保留沉淀, 加入2 0 m l 包涵体溶解缓冲液( 1 0 m m
17、o l / L T r is , 1 5 0 m m o l/ L N a C l , 1 m m o l / L E D T A , 2 m m o l / L D T T , p H 8 . 0 ) , 然后加入十二烷基肌胺酸钠, 终浓度为 5 %, 室 温静置3 0 m i n 或 5 0 0 W功率超声 5 m i n , 1 8 O O O r / m i n 离心3 0 m i n , 收集上清, 4 对 P B S 透析4 8 h以上复 性。 6 . 蛋白质We s t e r n 杂交: 采用B r a d e f o r d 法测定蛋 白含量。收获的蛋白经1 5 % S D
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