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1、人血管内皮细胞生长因子 1 6 5基因转染大鼠骨髓 基质细胞的实验研究* 白晓峰,田卫东,陈希哲,李志勇 四川大学华西口腔医学院 口腔颌面外科学教研室(成都6 1 0 0 4 1 ) 【摘要】 目的探讨对大鼠骨髓基质细胞进行重组人血管内皮细胞生长因子( VE G F ) 1 6 5基因修饰的可行性。 方法采用全骨髓细胞贴壁培养法获得稳定的大鼠骨髓基质细胞,分别在脂质体L i p o f e c t a mi n e T M2 0 0 0和新型的阳 离子聚合物S o f a s t介导下行p c D NA3 . 1 - VE G F 1 6 5转染骨髓基质细胞,在倒置显微镜下观察转染后细胞形态和
2、生长 情况的变化,通过免疫细胞化学鉴定VE G F在细胞中的表达情况。结果脂质体L i p o f e c t a mi n T M和新型阳离子聚合 物S o f a s t介导转染的阳性细胞率分别为1 1 . 3 4 %和1 1 . 4 2 %,两者无明显差异。而细胞存活率分别为7 4 . 6 0 %和 8 5 . 8 8 %,后者稍高于前者( P ? - 0 ,A- B 1C D ; 3 /= / 3E3 ; F - 0 B ; 1 ,G H e n I J K6 1 0 0 4 1 ,G H i n a 【 L M s t r a N t 】O M P e N t i Q eT H ep
3、 K R p o s eo ft H i ss t K J STa st oe U a V K a t et H ef e a s i W i V i t So fVE G F 1 6 5I e n e t R a n s f e c t i o n i n t o W o n e ma R R o T s t R o ma Vc e V V s a n J ma X e t H e I R o K n J To R X o fVE G F I e n e t H e R a p S f o R t H e R e U a s c K V a R i Y a t i o no f W o n
4、et i s s K ee n I i n e e R i n I .Me t Z o s o n ema R R o Ts t R o ma V c e V V s ( MS G )Te R ec K V t K R e J; 3F ; 1 0 4 , a n JTe R et e s t e Jf o Rt H eJ e a me t H a s o n e - i n J K c e Jp o t e n t i a V t of o R m mi n e R a V i Y e J - V i X et i s s K ei nc K V t K R ei nt H ep R e s
5、e n c e o f a s c o R W i ca c i Ja n JW e t a - I V S c e R o p H o s p H a t e .T H eU e c t o Rp c D NA3 . 1 - VE G F 1 6 5Ta st R a n s f e c t e Ji n t oW o n ema R R o T s t R o mac e V V sTi t Ht H eme t H o Jo f V i p o s o meme J i a t e Jo RS o f a s t t R a n s f e c t a m R e a I e n t .
6、T H ee p R e s s i o nV e U e V o f H K ma n VE G F 1 6 5i nt H et R a n s f o R me Jc e V V sTa sJ e t e c t e JW Si mmK n o c S t o c H e mi s t R S .R e s u l t s T H ep e R c e n to ft H ep o s i t i U e c e V V sa f t e RVE G F 1 6 5 I e n e t R a n s f e c t i o n me J i a t e J W S V i p o s
7、o me a n J c a t i o n i cp o V S me RTa s 1 1 . 3 4 a n J 1 1 . 4 2 R e s p e c t i U e V S .T H e R eTa sn os i I n i f i c a n tJ i f f e R e n c ei nI e n et R a n s f e Re f f i c a c SW e t Te e nV i p o s o mea n Jc a t i o n i cp o V S me R me J i a t e JI e n eJ e V i U e R S .H i V et H ep
8、 e R c e n to f t H en K mW e Ro f s K R U i U a V c e V V sa f t e RI e n et R a n s f e c t i o nTa s7 4 . 6 0a n J 8 5 . 8 8R e s p e c t i U e V S ,t H ec S t o i t So f V i p o s o meTa saV i t t V eH i I H e Rt H a nt H a to fc a t i o n i cp o V S me R .C o n N l u s i o nT H e e p e R i me n
9、 t J e mo n s t R a t e Jt H a t R H VE G F 1 6 5Ta s s K c c e s s f K V V Se p R e s s e Ji n MS G .T H i s R e s K V t c o K V Js e R U ea s aW a s i s f o Rt H en e t s t e po f R e U a s c K V a R i Y a t i o no f W o n et i s s K ee n I i n e e R i n I . 【 _e w o r s 】Va s c K V a Re n J o t H
10、 e V i a V I R o Tt Hf a c t o RG e n et R a n s f e c t i o n o n ema R R o Ts t R o ma V c e V V s 构建功能性的复合组织结构或器官一直是困扰 着生物医学领域的关键性问题。问题的焦点集中于 如何使重建或再生的组织内部获得血供而保证其正 常的生长代谢。对血循环的重建而言,血管内皮细胞 生长因子( VE G F )作为血管内皮细胞的特异性丝裂 原是血管形成最重要的调节因子,它通过刺激血管 内皮细胞的游走进一步建立新的血管网,并能改变 血管的通透性,促进血浆蛋白的渗出,形成富含纤维 素并有利于新血管形
11、成的细胞外基质a 1 b。实验表明 骨髓基质细胞( MS G )作为组织工程的种子细胞具 *教育部博士点基金( 1 2 0 0 2 0 6 0 0 6 0 )和教育部高校优秀青年 教师教学科研奖励计划项目( 2 0 0 3 6 8 2 )资助 G o R R e s p o n J i n Ia K t H o R 有多向分化的潜能,是骨组织工程研究中较为理想 的种子细胞之一a 2 b。因此,我们对大鼠 MS G进行 人VE G F 1 6 5的基因修饰,以探讨通过VE G F基因 治疗来获得生物工程组织的血循环重建的可行性。 1 材料和方法 1 . 1 材料 真核表达载体p c D NA3
12、. 1 - VE G F 1 6 5由第四军 医 大 学 口 腔 医 学 院 高 全 文 等a 3 b提 供。 L i p o f e c t a mi n e T M2 0 0 0购自美国 G i W c o公司, 新型的 阳离子聚合物转染试剂梭华- S o f a s t T M购自厦门太阳 马生物工程有限公司。鼠抗人血管内皮生长因子单 克隆抗体及免疫组化试剂盒购自北京中山生物技术 四 川 大 学 学 报(医 学 版) cS i N Z u a nd n i Q( Me S N i E i ) ee e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e
13、 e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e f g g 5 hi 6 ( j ) k j 6 lj m g 有限公司。 1 . 2 p c D N A 3 . 1 - V E G F 1 6 5的提取与纯化 用已构建好的真核表达质粒载体p c D NA3 . 1 - VE G F 1 6 5转化大肠杆菌,按质粒提取试剂盒中的说 明书小量提取质粒,纯化后保存备用。 1 . 3 大鼠B MS C的培养 取成年S D大鼠一只,引颈法将其处死后,取其 股骨,剪去上下骺端,用含2
14、 0 %小牛血清的 ME M 培养液冲洗骨髓腔,将骨髓细胞冲入培养皿中,用吸 管吹打使细胞尽可能的分散后接种于培养瓶内。 3 7、 5 0ml / LC O2、 饱和湿度下培养, 4 8h后换液。 多次贴壁法分离培养大鼠B MS C 。以胰蛋白酶消化 法进行传代。于倒置显微镜下观察细胞的形态和生 长情况。 1 . 4 大鼠骨髓基质细胞的鉴定 选取传代的 B MS C在矿化诱导液中培养,对 B MS C进行成骨定向诱导, 培养三周后,茜素红染色 以示钙化组织的形成情况。用光学显微镜观测细胞 的形态学特征。 1 . 5 V E G F 1 6 5基因转染大鼠骨髓基质细胞 胰蛋白酶消化后的B MS
15、C按1 1 0 9接种于六 孔 板。当 细 胞 生 长 至 9 0 % 9 5 %时,同 时 以 p c D NA3 . 1和p c D NA3 . 1 - VE G F 1 6 5分别在脂质体 L i p o f e c t a mi n e T M 2 0 0 0和 新 型 的 阳 离 子 聚 合 物 S o f a s t介导下转染B MS C , 具体方法按说明书进行。 同时以空载体转染和未转染的B MS C作为对照组。 1 . 6 免疫组化检测 转染4 8h后,取出细胞爬片,经9 5 0ml / L乙醇 固定1 0mi n , P B S冲洗,加3 0ml / L的H2O2室温2 0
16、 mi n灭活内源性过氧化物酶, P B S冲洗。加1 0 0ml / L羊血清封闭3 0mi n , 弃去多余的血清。以鼠抗人 VE G F 1 6 5单克隆抗体作为一抗( 1 :5 0 ) ,生物素标 记 的 羊 抗 鼠 抗 体 作 为 二 抗( 1 : 1 0 0 ) ,免 疫 组 化 S AB C法检测转染细胞中外源性VE G F 1 6 5的表 达。染色后细胞浆和细胞核呈棕色作为阳性细胞的 判断标准。计数1 0个高倍视野,计算阳性细胞数占 视野中总细胞数的百分比,得出阳性细胞率。MT T 法检测转染后的细胞存活率。 1 . 7 统计学方法 率的比较采用卡方检验。以P0 . 0 5 )
17、 。而细胞存活 率分别为7 4 . 6 0 %和8 5 . 8 8 %,后者稍高于前者( P 0 . 0 5 ) 。 3 讨论 组织工程学发展到今天,已经成功地将组织工 程皮肤应用于临床治疗。然而要进一步构建结构复 杂的组织或器官,保证其植入体内后存活并行使其 正常的功能,就必须解决组织工程血管化的问题。目 前已对以下几种方法进行了探索:应用生物材料的 缓释系统达到促进血管形成的细胞因子在体内定 时、定量的释放以刺激新生血管的形成 4 ;VE G F 、 b F G F 、 P D G F等细胞因子基因导入种子细胞, 经植 入体内后获得细胞因子的稳定的表达以诱导血管长 入组织内部 5 ;应用血
18、管形成前体细胞进行干细胞 的局部治疗以获得生物组织内的血循环重建 6 ;在 体外或体内构建带有血管蒂的生物组织,经显微外 科移植以修复或替代缺损的组织器官 7 。其中通过 将VE G F编码基因导入细胞的基因修饰已成为获 得血循环重建的最具发展潜力的治疗模式之一。干 细胞作为组织工程的种子细胞的同时,又成为向体 内导入基因的载体。目前,骨髓间充质干细胞、脂肪 干细胞、造血干细胞和肌原细胞都已作为基因导入 的载体而投入研究。本研究利用血管内皮生长因子 基因转染的干细胞植入体内,以期探讨组织工程血 管化的途径。 本研究选用分泌型 VE G F 1 6 5的编码基因,将 其导入骨组织工程的种子细胞-
19、骨髓基质细胞, 获得了外源性VE G F的表达。所以,我们可以进一 步将阳性表达的细胞继续按照组织工程骨的构建模 式来完成体内工程化骨组织的血循环重建。同时本 研究发现B MS C经转染后其细胞存活率有所下降, 其能否完成体外大量增殖以及同支架材料的复合培 养将有待进一步探讨。 基因转染是利用转染试剂将携带有目的基因的 载体运送到细胞内。早期的磷酸钙转染法转染效率 很低,且对很多细胞株无效,因此不能满足很多科研 工作的需要。目前,最常用的转染试剂是阳离子脂质 体和阳离子聚合物,作为两种不同的非病毒载体,它 们在克服细胞屏障方面跟病毒有相似的特征,容易 透过细胞膜。其中,阳离子脂质体在体外基因转
20、染中 有很高的效率,然而在体内,它迅速被血清清除,在 肺组织内累积,诱发强烈的炎症反应,因此在很大程 度上限制了其应用。由于阳离子脂质体的局限性,阳 离子聚合物转染试剂日益受到重视。本研究比较了 传统的脂质体和新型的阳离子聚合物的转染效率和 细胞毒性,旨在探索更为高效的转染方法。阳离子聚 合物作为基因转染载体能够浓缩D NA,促进细胞吞 噬聚合物/ D NA复合体。由于阳离子聚合物能在细 胞内涵体中形成吸收质子的“海绵“ ,从而使之崩解, 而使D NA免受内涵体酶解,并使其在细胞核内释 放,从而提高基因表达水平 8 。S o f a s t新型的阳离 子聚合物具有很强的D NA结合能力,本研究
21、结果 显示其转染效率与传统的脂质体无明显差别,而细 胞毒性略小于传统的脂质体。 参考文献 1Ne u f e l d G, C o h e n T , G e n g r i n o v i t c h S , e ta l . Va s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o wt hf a c t o ra n di t sr e c e p t o r s .F AS E BJ , 1 9 9 9 ; 1 3 ( 1 ) : 9 . 2B r u d e rS P ,J a i s wa l N,R i c a l t o nNS ,e t a l .
22、Me s e n c h y ma l s t e m c e l l s i n o s t e o b i o l o g y a n d a p p l i e d b o n e r e g e n e r a t i o n . C l i n Or t h o p , 1 9 9 8 ; 3 5 5 ( S u p p l ) : S 2 4 7 . 3 高全文,董绍忠,陈希哲等.人血管内皮生长因子1 6 5基因真核 表达载体的构建及表达.细胞与分子免疫学杂志, 2 0 0 3 ; 1 9 ( 1 ) : 3 2 . 4R i c h a r d s o n T P , P e t
23、 e r sMC , E n n e t tAB , e ta l . P o l y me r i c s y s t e mf o r d u a l g r o wt hf a c t o r d e l i v e r y .Na t B i o t e c h n o l , 2 0 0 1 ; 1 1 ( 1 9 ) : 1 0 2 9 . 5S o k e rS , Ma c h a d o M, At a l a A. S y s t e ms f o r t h e r a p e u t i c a n g i o g e n e s i si nt i s s u ee
24、n g i n e e r i n g .Wo r l dJUr o l , 2 0 0 0 ; 1 8 ( 1 ) : 1 0 . 6C a r me l i e t P .D e v e l o p me n t b i o l o g y .On ec e l l t wof a t e s .Na t u r e , 2 0 0 0 ; 4 0 8 ( 6 8 0 8 ) : 4 3 . 7Mi a nR ,Mo r r i s o nWA,Hu r l e yJ V,e ta l .F o r ma t i o no fn e w t i s s u ef r o m a n a r
25、 t e r i o v e n o u sl o o p i n t h ea b s e n c eo fa d d e d e x t r a c e l l u l a r ma t r i x .T i s s u eE n g , 2 0 0 0 ; 6 ( 6 ) : 5 9 5 . 8B r o wnMD ,S c h a t z l e i nAG,Uc h e g b uI F .G e n ed e l i v e r ywi t h s y n t h e t i c( n o nv i r a l )c a r r i e r s .I n t J P h a r m, 2 0 0 1 ; 2 2 9 ( 12 ) : 1 . ( 2 0 0 41 01 3收稿, 2 0 0 50 11 8修回) 编辑罗锋 074 四川大学学报(医学版)2 0 0 5年第3 6卷第4 = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = 期
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