人肝细胞生长因子基因重组腺病毒载体的构建.pdf
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1、人肝细胞生长因子基因重组腺病毒载体的构建* 王祥1 刘本德1 曾秋棠1 阮秋蓉2 摘要 目的: 利用A D - E A S YTM系统, 构建高效而又安全的肝细胞生长因子(HG F) 基因腺病毒载体(A d - HG F) , 以研究HG F基因在心脏内的表达。方法: 从人胎肝中抽提总R NA, 并以该肝细胞总R NA为模版, 利用 合成的1对引物, 采用R T - P C R技术获得HG F基因的c D NA, 并引入酶切位点, 先转入感受态质粒, 再转化大肠 杆菌进行扩增, 筛选阳性菌落, 经酶切及测序, 证实目的HG F基因已经转入, 再将该基因转入p U C 1 8质粒, p U C
2、1 8质粒与A d - E A S Y质粒进行同源重组, 用 P a c 酶切成线性化D NA, 利用脂质胺转染2 9 3细胞, 经3轮扩 “, 制备高效表达并用绿色荧光标志A d - HG F。并将该载体作实验组, 与HG F组作比较, 观察对V E C的抗凋亡 作用。结果: 在荧光显微镜发现2 9 3细胞发光率为1 0 0%,A d - HG F的HG F c D NA经过测序鉴定与基因库序列一 致。结论:A d - HG F的成功构建, 为冠心病转基因治疗的基础与临床研究奠定了基础。 关键词 肝细胞生长因子; 腺病毒; 载体; 基因治疗 中图分类号 R 3 7 3. 1 文献标志码 A
3、文章编号 1 0 0 1 - 1 4 3 9(2 0 0 6)0 4 - 0 2 3 8 - 0 4 C o n s t r u c t i o no fa d e n o v i r u s - r e c o m b i n e dv e c t o ro fh e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o r WANGX i a n g 1 L I UB e n d e1 Z ENGQ i u t a n g1 R UANQ i u r o n g2 ( 1D e p a r t m e n to fC a r d i o l o g y, U n i o
4、n H o s p i t a l,T o n g j iM e d i c a lC o l l e g e,H u a z h o n gU n i v e r s i t yo f S c i e n c ea n dT e c h n o l o g y,Wu h a n,4 3 0 0 2 2,C h i n a; 2D e p a r t m e n to fP a t h o l o g y, T o n g j iM e d i c a lC o l - l e g e,H u a z h o n gU n i v e r s i t yo fS c i e n c ea n
5、dT e c h n o l o g y) A b s t r a c t O b j e c t i v e:T oc o n s t r u c th i g he f f i c i e n ta n ds a f ea d e n o v i r u sv e c t o ro fh e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o r(A d - HG F)g e n er e c o m b i n a t i o nw i t hA D - E A S Y TMs y s t e mi no r d e r t or e s e a r c ht h e
6、e x p r e s s i o no fHG Fg e n e i nt h eh e a r t . M e t h o d:T oe x t r a c t t o t a lR NAf r o mh u m a nf e t a l l i v e r,t a k et h et o t a lR NAo fh e p a t o c y t ea sm o d e l,u s eap a i ro f s y n t h e t i cp r i m e r s,a d o p tR T - P C Rt e c h n i q u e t oo b t a i nc D NAo
7、fHG Fg e n ea n di n s e r te n z y m ec u t t i n gs i t e,t u r nt o c o m p e t e n c ep l a s m i d f i r s t,a n d t h e n t r a n s f e r t h e c o l i b a c i l l u s t oa m p l i f y,s c r e e n t h ep o s i t i v e c o l o n y,e n s u r e t h e t a r g e - t e dHG Fg e n eb e i n gt r a n s
8、 f e r r e da f t e r e n z y m ec u t t i n ga n ds e q u e n c i n g,t h e nt r a n s f e r t h eg e n e i n t op U C 1 8p l a s m i d, c a r r yo u t h o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o nw i t hp U C 1 8p l a s m i da n dA D - E A S Yp l a s m i d,e n z y m e c u t t i n g i n t o l i n e
9、 a r i z a t i o n D NAw i t hP a c I,u s e f a t t ya m i n e t ot r a n s f e c t 2 9 3c e l l,a m p l i f yt h r e et i m e s,A d - HG Fg e n er e c o m b i n a t i o nl a b e l l e d b yf l u o r e s c e n c ew a sp r e p a r e dw i t hh i g he f f e c t i v ee x p r e s s i o n .R e s u l t:HG
10、Ff u l l l e n g t hc D NAh a sb e e nc l o n e da n d r e c o m b i n a n tHG Fa d e n o v i r u sv e c t o rw a sc o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y,a ss h o w nb yP C R,r e s t r i c t i n ge n d o n u c l e a s ed i - g e s t i o na n a l y s i sa n df l u o r e s c e n c ed e t e c t i
11、 o n . I tw a s f o u n dt h a t 2 9 3c e l l l u m i n a n c ew a s1 0 0% u n d e r t h e f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p e . C o n c l u s i o n:Ar e c o m b i n a n t a d e n o v i r u sv e c t o r o fHG Fw a s c o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l yw h i c hm a yb e ap o - t e n t
12、 i a lb a s i s f o r t h eg e n e t h e r a p yo f c o r o n a r ya r t e r yd i s e a s ea n de s t a b l i s h e da f o u n d a t i o nf o r f u r t h e rs t u d y . K e yw o r d s H e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o r;A d e n o v i r u s;V e c t o r;G e n e t h e r a p y *基金项目: 湖北省自然科学基金( N
13、o:2 0 0 4 A B A 2 2 2) 1华中科技大学协和医院心内科 华中科技大学同济医学院心 血管病研究所(武汉, 4 3 0 0 2 2) 2华中科技大学同济医学院病理学系 导师 通讯 作 者: 王 祥,E m a i l:w x i a n g 1 2 8y a h o o . c o m. c n/w x - i a n g 1 2 8h o t m a i l . c o m 研 究 表 明,肝 细 胞 生 长 因 子 (h e p a t o c y t e g r o w t hf a c t o r,HG F) 是一种具有多功能的生物大 分子, 它能促进肝细胞、 肾小管上
14、皮细胞、 胃黏膜细 胞以及血管内皮细胞等的增生与分裂; 抑制肿瘤细 胞的生长与迁移 1,2。其中较为突出的是对内皮细 胞的保护和促分裂作用。在血管损伤后重建过程 中内皮的及时修复对防止血管狭窄等方面有重要 作用 3。目 前 多 使 用 基 因 转 染 的 方 法, 使 含 有 HG F基因的真核表达载体进入动物体内, 使之于 靶组织局部表达 4。可供真核基因表达的载体很 多, 如质粒、 噬菌体、 反转录病毒载体等 5。本实验 拟构建含人HG F基因的重组腺病毒载体( a d e n o - v i r u s v e c t o r o f h e p a t o c y t e g r o
15、w t h f a c t o r,A d - HG F) , 旨在为下一步冠心病的基因治疗研究提供 基础。 1 材料与方法 1. 1 材料 各种试剂盒如:R NA抽提试剂盒、 胶回收试剂 盒等均为G e n eV公司产品, 各种限制性内切酶如 X b o 、E c o r V、N h e 和P a c 均来自基因有限公 司,DMEM培养基来自H y C l o n e - P I E R C E公司, 胎牛血清来自G i b c o公司,HE K 2 9 3细胞系本院卢 实博士馈赠, 携带荧光蛋白的腺病毒来自中国科学 832 JC l i nC a r d i o l(C h i n a)
16、,A p r2 0 0 6,V o l 2 2,N o4 院病毒研究所。P C R仪、-8 0冰箱、 细胞培养箱 以及离 心 机 均 来 自 美 国 三 元 公 司, 显 微 镜 来 自 O l y m p u s公司。 1. 2 方法 1. 2. 1 总R NA的抽提及R T - P C R 从-8 0冰 箱中取出预先保留的包膜完整人胎肝1g, 按R NA 抽提试剂盒说明书方法一步抽提出总R NA, 并放 入-2 0冰 箱 备 用。应 用P r i m e r分 析 软 件 对 HG F序列进行分析, 设计1对P C R引物: 引物F:5 C C G G C T T G C AA C AT
17、T C T T 3 ;引物R:5 T G C T - T C AAATA C A C T G G C C T C T T C TA 3 。按 以 下 顺 序加样: 1 0mm o l/Lb u f f e r 1l,2 5mm o l/L氯化镁 2l,1 0mm o l/Ld NT P1l,R n a s e0. 2l,R t a s e 0. 2l,T a g0. 2l, 引物F0. 4l, 引物R0. 4l, 总R NA3. 6l,D E P Cd d H2O1. 0l。合计总体积 1 0l。反应条件:9 4 5 0s,5 4 6 0s,7 2 9 0s。 扩增3 5轮。以抽提肝组织R N
18、A为对照组, 以扩增 产物为实验组进行电泳分析, 对所得扩增产物行胶 回收, 胶回收按试剂盒说明书进行。 1. 2. 2 转化大肠杆菌 取3 0 l已经准备好的感 受态质粒, 加入3lP C R产物, 在冰水中轻轻旋转 3 0m i n, 然后4 2热击4 5s, 冰浴3m i n, 加入2 5 0 lN Z Y,于3 7 2 2 52 5 0r/m i n摇床复苏1h。 吸取1 5 0l转化物, 铺已经备好的L B平板, 3 7 培养箱中培养2 44 8h。挑选生长良好的菌落, 加 入5 0 0m lL B培养基中摇菌2 4h。 1. 2. 3 腺病毒穿梭质粒S h u t t l e -
19、CMV - HG F的构 建 取出p U C 1 8质粒的L B培养液, 80 0 0r/m i n 离心2m i n, 抽提质粒, 用X b a回收得到2 . 2k b 的D NA片段, 用N r u和P v u双酶切p c D NA 3, 回收约1. 0k b的D NA片段, 将这2个片段连接得 质粒p UD( 约3. 3k b) 。用A v a和S s p双酶切 p UD, 回收约2. 7k b的D NA片段, 另用 AVR酶 切p E G F P - N 1, 回收约1. 1k b的D NA片段, 该片 段含有完整的卡那霉素基因, 连接2个回收D NA 片段得质粒p UD K( 约3.
20、 8k b) 。然后将HG F c D - NA克隆至p UD K载体的多克隆位点, 获得携带人 HG F基因的重组质粒载体, 命名为p UD KH(6. 0 k b) 。用B a mH I和H i n d双 酶 切p c D NA 3 L a c Z 后, 回收大小约3. 0k b的D NA片段, 将其插入至 p UD K载体的B a mH I和 H i n d位点, 获得S h u t - t l e - CMV - HG F质粒。 1. 2. 4 制备含HG F基因的p A d E a s y - 1质粒载体 取4只无菌的1. 5m l的离心管( 分别标记为a、 b、c、d) 和0. 2
21、c m的电转化杯, 在冰上预冷; 取适量 的B J 5 1 8 3感受态细胞, 于冰上融化; 向每个离心管 中加入4 0l左右的B J 5 1 8 3感受态细胞。在a管 中, 加入1l( 1m g /L) 线性化的去磷酸化的S h u t - t l e - CMV - HG F质粒和1l(1 0 0g/L) 超螺旋的 p A d E a s y - 1质粒载体, 轻轻混匀后置于冰上放置; 在b管中, 加入1l( 1g /L) 线性化的去磷酸化的 S h u t t l e - CMV - l a c Z和1l(1 0 0g/L) 超 螺 旋 的 p A d E a s y - 1质粒载体,
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- 关 键 词:
- 肝细胞 生长因子 基因 重组 病毒 载体 构建
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