人类巨细胞病毒特异性CD8 T细胞IFNγ和穿孔素水平的检测.pdf
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1、文章编号 1000-8861 (2006) 04-0440-04 人类巨细胞病毒特异性 CD8 + T 细胞 IFN-和穿孔素水平的检测 查庆兵a, 徐丽慧b, 迟晓云a, 何贤辉a*, 肇静娴a(暨南大学生命科学技术学院 a.组织移植与免疫研究中 心; b. 生物工程研究所,广州 510632) 收稿日期 2006 - 01 - 20;修回日期 2006 - 04 - 03 基金项目 国家自然科学基金重点项目 (30230350) 和国家自然科学 基金面上项目 (30371651, 30572199) 资助 作者简介 查庆兵 (1975 - ) , 男, 安徽安庆市人, 硕士生, 主要从事分
2、 子和细胞免疫学研究。 (Tel)020-85220679;(E-mail)thexh *通讯作者 摘要 目的研究人巨细胞病毒 (hCMV) 结构蛋白 pp65 衍生抗原肽 (pp65495-503,NLV) 特异性 CD8 + T 细胞的功能特 性。方法将 HLA-A2/NLV 四聚体染色与细胞内细胞因子或穿孔素染色相结合, 以流式细胞仪直接分析 NLV 特异性 CD8 + T 细胞内穿孔素的表达水平, 或者在 NLV 抗原肽刺激 6 h 后分析-干扰素 (IFN-) 的表达水平。结果NLV 抗原肽能诱导 hCMV 特异性 CD8 + T 细胞分泌 IFN-, 不同供者特异性 CD8 +
3、T 细胞产生 IFN-的比率存在较大差异 (55.69 17.64)%, 当 NLV 抗原 肽质量浓度为 10g/mL 时 IFN-阳性细胞百分率最高; 未经刺激的特异性 CD8 + T 细胞内表达较高水平的穿孔素 (53.90 16.41) %。结论识别单一表位的 hCMV 特异性 CD8+ T 细胞合成 IFN-和穿孔素的能力存在多样性。 关键词 巨细胞病毒; CD8 + T 细胞; 四聚体; 细胞内细胞因子染色; 流式细胞术 中图分类号 R392.12文献标识码 A Detection of IFN-and perforin expressions in human cytomegalo
4、virus-specific CD8 + T cells ZHA Qing-bing,XU Li-hui,CHI Xiao-yun,HE Xian-hui,ZHAO Jing-xian(Institute of Tissue Transplantation and Im- munology,College of Life Science and Technology,Jinan University,Guangzhou 510632,China) Abstract ObjectiveTo investigate the functional characteristics of CD8 + T
5、 cells specific to human cytomegalovirus(hCMV)struc- tural protein pp65-derived peptide antigen(pp65495-503,NLV) . MethodsPerforin expression without stimulation was analyzed with flow cy- tometry by using HLA-A2/NLV tetramer staining together with intracellular staining,while-interferon(IFN-)expres
6、sion was evaluated by using tetramer staining in combination with intracellular cytokine staining after stimulation with NLV peptide for 6 h. ResultsIFN-was ex- pressed in hCMV-specific CD8 + T cells after induction of the NLV peptide,and the expression levels of IFN-in different donors were highly
7、variable (55.69 17.64) % . The optimal concentration of the NLV peptide was 10g/mL. Moreover,perforin was expressed at high level (53.90 16.41)%within unstimulated antigen-specific CD8 + T cells. ConclusionThe hCMV-specific CD8 + T cells recognizing single epitope are heterogeneous in synthesizing I
8、FN-and perforin. Key words Cytomegalovirus;CD8 + T cells;Tetramer;Intracellular cytokine staining;Flow cytometry 人类巨细胞病毒 (human cytomegalovirus, hCMV) 是疱疹病毒科属的 DNA 病毒, 在正常人群中普遍 感染, 发 达 国 家 人 群 血 清 hCMV 抗 体 检 出 率 约 40% 60%, 发展中国家超过 90% 1。通常表现为 无临床症状, 称无症状性 hCMV 感染 (或隐性 CMV 感染) , 出现临床症状者称症状性 hCMV 感染或
9、CMV 病。健康人群 hCMV 感染多为隐性感染或症状轻 微, 在新生儿、 器官移植受者、 艾滋病患者等免疫功 能低下的人群, hCMV 感染可引起严重临床症状, 如 致命的间质性肺炎和致盲的 hCMV 视网膜炎等 2。 抗原 特 异 性 CD8 + T 细 胞 又 称 细 胞 毒 T 细 胞 (cytotoxic T lymphocytes, CTL) , 在控制 hCMV 的复 发和感染中发挥关键作用。近年来, 利用主要组织 相容性复合体 (major histocompatibility complex, MHC) 类分子四聚体 (MHCtetramer) 技术对 hCMV 对 抗原特异
10、性 CTL 进行定量分析, 加深了对 CMV 病的 发病机制的了解, 并在预测移植受者发生 CMV 病等 领域具有潜在的应用价值 3。我们将四聚体染色与 细胞内细胞因子染色相结合, 检测中国人 hCMV 特 异性 CD8 + T 细胞的功能特性, 不仅可以分析 hCMV 特异性 CD8 + T 细胞的频率, 而且能够测定这些细胞 的潜在功能, 对于深入了解 hCMV 特异性免疫应答 过程具有重要意义。 1材料与方法 1.1血样年龄在 20 30 岁之间的健康志愿者肝 素抗凝静脉血取自广州华侨医院体检中心。 1.2主要试剂和仪器荧光标记小鼠抗人单抗 anti- CD8-APC、 anti-IFN
11、-FITC、 anti-Perforin-FITC 等 购 自 美国 eBioscience 公司,hCMV 特异性 IgG 检测试剂盒 044免 疫 学 杂 志第 22 卷第 4 期2006 年 7 月IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol. 22 No. 4 July 2006 购自美国 Biocheck 公司, 淋巴细胞分离液购自上海 华精生物高科技公司, Streptavidin-PE 购自 Molecular Probes, 皂素 (saponin) 、 离子霉素 (ionomycin) 和莫能菌 素 (monensin) 为美国 sigma 产品, 佛波醇酯 (12,
12、13- dibutyrate phorbol, PDB )购 自Calbiochem 公 司, pp65495-503 NLV 抗原肽(NLVPMVATV) 抗原肽由上 海博亚 (Bioasia) 公司合成, 流式细胞仪 (FACSCalibur) 为美国 Becton Dickinson 公司产品。 1.3HLA-A2 表型鉴定和血清 hCMV 特异性 IgG 测定采用直接免疫荧光染色法结合流式细胞仪鉴 定志愿者是否为 HLA-A2 阳性 4; 血清 hCMV 特异性 IgG 按试剂盒建议方法进行,判定结果所有供者均 为阳性。 1.4HLA-A2/NLV 四 聚 体的制备生物素化的 HLA-
13、A2/NLV 可溶性单体按前文报道 5 的方法合 成; 将生物素化的 HLA-A2/NLV 单体按比例 (4:1) 与 Streptavidin-PE 混 合, 室 温 置 30 min 后, 即 可 形 成 HLA-A2/NLV 四聚体, 于 4保存备用。 1.5外周血的体外活化取 HLA-A2/NLV 四聚体 阳性供者外周血 300L 与 RPMI-1640(含 100 mL/L 小牛血清、 50mol/L-巯基乙醇、 100 U/mL 青霉素、 100 mg /L 链霉素) 按 1 : 2 混合后培养于 24 孔培养 板, 或 在 培 养 前 以 四 聚 体 进 行 染 色 (37 温
14、育 30 min) , 阴性对照孔不加抗原肽, 阳性对照孔加入 PDB 和离子霉素刺激, 样品孔分别加入不同浓度的 NLV 抗原肽进行刺激, 所有孔内 (包括对照) 均加蛋 白转运阻断剂莫能菌素 (2 mol/ L) , 混匀后置于 37, 50 mL/L CO2饱和湿度的孵箱中培养 5 h。 1.6细胞内细胞因子染色收集培养后的细胞悬 液 300L, 离心浓缩至 100L, 每管加入 0.3g HLA- A2/NLV 四聚体和 20L anti-CD8-APC, 刺激前染过 四聚体的只加 20L anti-CD8-APC, 4 温育 30 min 后, 每管加入 3 mL 红细胞裂解液, 室
15、温避光放置 6 8 min, 1 500 r/min, 离 心 5 min 弃 上 清 液, 以 PBS (phosphate-buffered saline, pH7. 4)洗 涤 2 次,加 0.2 mL 40 g/L 多聚甲醛固定 20 min(4 ) , 1 500 r/ min, 离心 5 min 除去上清液, 以含 10 mL/L 牛血清白 蛋白的 PBS 洗涤 2 次, 再在每管中加入 1 mL 通透液 (1 g/L 皂素,1 g/L NaN3,10 mL/L 小牛血清, 配于 PBS) , 室温避光 10 min, 1 500 r/min, 离心 5 min 弃上 清液, 2
16、mL通透液洗一次, 细胞重悬于 100L 通透 液, 加入 20L anti-INF-FITC 于 4避光放置30 min, 2 mL通透液洗 2 次 (1 500 r/min, 5 min) , 加0.3 mL 40 g/L 多聚甲醛固定后以流式细胞仪进行分析。 1.7特异性 CD8 + T 细胞内穿孔素染色分析取 100L 四聚体阳性供者全血, 加入 20L anti-CD8- APC, 4温育 30 min 后, 裂解红细胞, 固定后加入通 透液, 再加入 1.6L anti-Perforin-FITC,4 避光放置 30 min, 2 mL 通透液洗两次 (1 500 r/min, 5
17、 min) , 加 0.3 mL 40 g/L 多聚甲醛固定后以流式细胞仪进行分析。 1.8流式细胞仪分析所有样品以装备 488 nm 和 635 nm 激光的 FACSCalibur 流式细胞仪进行分析。 前向散射 (FSC) 和侧向散射 (SSC) 以线性信号收集, 荧光强度以对数 (0 1 104) 度量收集。先在在 FSC-SSC 二维散点图上划出淋巴细胞区, 然后进行 淋巴细胞上的 FITC(FL1) 、 PE(FL2) 及 APC(FL4) 的 荧光强度检测, 其中重叠荧光经补偿消除。测定时 每个样品检测 10 万个细胞, 数据以 CELLQuest 软件 (美国 Becton D
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