人肝细胞L02聚丙烯杂化界面的初步研究肝细胞球形聚集体培养.pdf
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1、 2 1 0 由华盯胆外科杂志2 0 0 6 年3 月第 1 2 卷第3 期C h i n J H e p a t o b i l i a r y S u r g , Ma r 2 0 0 6 , V o l . 1 2 , N o . 3 论 著 摘 要 人肝细胞 L - 0 2 / 聚丙烯杂化界面的初步研究: 肝细胞球形聚集体培养 彭承宏韩宝三高长有马祖伟王涌刘宏赵之明唐In 生物人工肝( b i o a r t i f i c i a l l i v e r , B A L ) 在肝功能 衰竭中的治疗价值已得到肯定 1 -4 ) , 大量高活性的 人肝细胞是细胞型体外B A L支持系统的
2、核心原材 料 2 , 5 , 6 ) 。球形聚集体是一种立体、 高密度、 高活性 培养肝细胞的方法 3 ,6 ) , 但操作较复杂 2 ,3 ,6 8 ) 。我们 采用生物材料表面接枝功能化学基团的方法, 对人肝 细胞L - 0 2 / 聚丙烯杂化界面进行了研究, 并通过简单 的 静止培养实现了 肝细胞的 球形聚 集体培养方式, 极 大的简化了既往的肝细胞球形聚集体培养方法。 材料与方法 1 . 材料: 聚丙烯( p o l y p r o p y l e n e , P P ) 透明薄膜 由上海鸣丰塑料有限公司定制惠赠, 正常人肝细胞 系L - 0 2 购自中国 科学院上海细胞生物研究所,
3、培养 基R M P I 1 6 4 。 购自G i l b c o 公司, 胎牛血清购自 杭 州四季青生物制品公司, 细胞培养瓶( O r a n g e S c i e n - t i f i c , 比利时) 为聚苯乙烯( t i s s u e c u l t u r e p o l y s t y - r e n e , T C P S ) 。 2 . P P 膜的化学接枝改性: P P膜的接枝改性包 括光氧化、 接枝聚合、 漂洗三个步骤。 光氧化: 将P P 膜浸于3 0 0 o H 2 姚 石英聚合管中, 2 5 0 W高压汞灯 辐照, 旋转石英管9 r / m i n , 恒温5
4、 0 反应4 h 。 接 枝聚合: 将氧化后的P P 膜于1 0 m l 5 0 o A M单体聚 合管中除氧充氮, 加 1 m l 0 . 0 1 5 m o 丫 L硫酸亚铁 钱, 恒温3 0 聚合 3 0 m i n , 使得 A M在 P P膜表面 接枝聚合, 得到表面接枝聚丙烯酞胺( p o l y a c r y l a m - id e , P A M) 的P P 膜。 漂洗: 去离子水漂洗。 3 . P P 膜和接枝P P膜表面静态水相接触角的 测定: 静态水相接触角的 测定采用滴液法, 水滴。 . 8 川。每个样本取 1 0 个检测点, 实验重复3 次。 基金项目: 国家自 然
5、科学基金资助( 基金编号: 2 0 0 7 4 0 3 1 ) 作者单位: 3 1 0 0 0 9 杭州市, 浙江大学医学院附属二院普外科( 彭承 宏、 韩宝三、 王涌、 刘宏、 赵之明、 唐品) ; 2 0 0 0 2 5 上海市, 上海第二医 科大学瑞金医院外科( 彭承宏) ; 3 1 0 0 2 7 杭州市, 浙江大学高分子复 合材料研究所( 高长有、 马祖伟) 4 . 肝细胞 L - 0 2 在 P P , 接枝 P P表面细胞相容 性的观察: 于2 4 孔培养板铺垫P P 、 接枝P P , 倒置显 微 镜( p h a s e c o n t r a s t m i c r o s
6、 c o p e , P C M ) 、 激光共聚 焦显微镜 ( la s e r s c a n n i n g c o n f o c a l m i c r o s c o p e , L S C M) 动态观察L - 0 2 在不同生物材料表面的生长 情况, 并以T C P S 作为正常对照。 5 . 肝细胞L - 0 2 在T C P S , P P和接枝P P表面增 殖活性的测定: 收集不同材料表面生长的L - 0 2 , 制 备单细胞悬液, 7 0 %乙醇固定2 4 h 后加 2 0 0风 R n a s e A( 1 m g / m l ) , 3 7 C水浴 3 0 m i
7、n , 碘化丙陡染 色液( 5 0 r tg / m l ) 孵育3 0 m i n , F C M分析细胞周期, 实验重复3 次。 6 . 统计 学分析: 数据 分析 用统 计软件S S P S V I I . 5 , 组间比 较采用t 检验 P 0 . 0 5 为有显著哇 意义。 结果 1 . P P 膜和接枝P P 膜表面静态水相接触角的 测定: P P膜接枝改性前静态水相接触角 7 2 . 3 0 士 5 . 4 , 而接枝P P为2 9 . 6 0 士3 . 8 , 两者差异有显著性 ( P0 . 0 5 ) 。 2 , 肝细胞 L - 0 2 在 T C P S , P P 、 接
8、枝 P P表面细 胞相容性的形态学观察: L - 0 2 在T C P S , P P和接枝 P P 表面的 生长特点明显不同。L - 0 2 在T C P S 表面 接种 1 2 h 多数细胞已铺展并进人对数生长期, 细胞 逐渐互相衔接, 紧密相靠( 图1 - A ) . L - 0 2 在P P 膜 表面的粘附较T C P S 表面为差, 1 2 h 约2 0 %细胞粘 附、 伸展, 但伸展度较 T C P S表面为差, 增殖缓慢并 有少量坏死细胞( 图1 - B ) o L - 0 2 在接枝P P 膜表面 始终未见细胞粘附、 铺展, 培养8 h 多数细胞已聚集 成多细胞的 球形体, 继
9、续培养可见始终呈多细胞球 形集聚生长, 大小不等, 并逐渐增大, 聚集体直径多 数在5 0 1 5 0 t m , 各聚集体之间常相互粘连, 轻微 振荡可以散开细胞团( 图 1 - C ) o A O荧光素与细胞 内D N A结合呈亮绿色, 而R N A结合呈橘红色至火 红色。球形聚集体中的肝细胞呈亮绿色和橘红色相 中华肝胆外科杂志2 0 0 6 年3 月第1 2 卷第3 期 C h i n J H e p a t o b il i a r y S u r g , M a r 2 0 0 6 , V o l . 醒, N o . 3 间, 提示球形聚集体的细胞生长活跃, D N A和R N A
10、合成活跃( 图1 - D ) 。 图1 人肝细胞 L - 0 2 在T C P S , P P和改性 P P 表面生长的形态学( A , B , C为P C MX 3 0 0 , D为L S C MX 2 0 0 ) 3 . 肝细胞 L - 0 2 在 T C P S , P P和接枝 P P表面生 长时增殖活性的检测结果: L - 0 2 在接枝P P膜表面 呈球形聚集体方式生长时的S 期及G / m期比例显 著高于T C P S 和P P 膜表面, 而G o / G : 则明显低于 两组对照( P 0 . 0 5 ) , 见表 1 。 表 1 人肝细胞 L - 0 2 在 T C P S
11、, P P和接枝P P 表面 生长时的细胞周期构成 材料 细胞周期构成( x 士、 ) % Go / GG2 / M TCP S P P 接枝 P P * 5 1 . 3 士3 . 2 6 2 . 2 士3 . 3 3 5 . 5 士3 . 1 2 8 . 6 士2 . 8 2 1 . 5 士3 . 1 3 5 . 9 士3 . 2 2 0 . 1 士2 . 5 1 6 . 3 士2 . 7 2 8 . 6 士2 . 8 注: 、 与对照组T C P S , P P比 较, P GO . 0 5 讨论 普通单层肝细胞培养难以 实现肝细胞的大量扩 增, 在取用时还需胰酶消化, 这会对肝细胞造成一
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