人胚胎干细胞向生殖细胞分化的研究进展.pdf
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1、人胚胎干细胞向生殖细胞分化的研究进展* 郭 新 蔡志明 桂耀庭 (北京大学深圳医院男性生殖医学实验室, 深圳 518036) 摘要 小鼠胚胎干细胞体外已成功诱导分化为配子细胞, 人胚胎干细胞理论上也具备分化为生殖 细胞的潜能。本文从影响人胚胎干细胞体外向生殖系分化的基因调控和干细胞小生境 (niche) 方 面进行综述, 并指出胚胎干细胞在生殖医学及不孕治疗中的研究方向和应用前景。 关键词 人胚胎干细胞; 生殖细胞; 小生境; 基因 中图分类号 R699 Progress in the Research of Germ Cell from Human Embryonic Stem Cells
2、GUO Xin,CAI Zhi- Ming,GUI Yao-Ting(Laboratory of Male Reproductive Medicine,Shenzhen Hospital of Peking University, Shenzhen 518036,China) Abstract As the development of spontaneous differentiation of germ cells and gametogenesis from mouse embryonic stem cells (mES)in vitro,hES(human embryonic stem
3、 cells)also have potential to differen- tiated into germ cells in theory. This review focuses on the stem cells niches and genes regulating the hES differentiation toward germ cells,as well as the recent advance and application on the reproductive medi- cine and therapy of infertility. Key words hum
4、an embryonic stem cell;germ cell;stem niche;gene 自从 1998 年威斯康星大学的汤姆生和约翰. 霍 普金斯大学的吉尔哈特教授分别在 Science 和 PNAS 上报道, 用不同方法获得了人胚胎干细胞 (human embryonic stem cells,hES) , 这就意味将打 开在体外生产所有类型的可供移植治疗的人体细 胞、 组织乃至器官的大门。而随后的大量研究也证 实了 hES 的多能性, 可分化为造血、 神经、 胰腺、 肌 肉、 血管和内皮细胞等多种细胞系, 然而生殖细胞方 面却未见有报道。直到 2003 年 5 月, Scienc
5、e 的一 篇报道引起所有从事 ES 研究人员的注意, 提出鼠 胚胎干细胞 (mES) 体外可分化为卵母细胞。从 2003 2004 年, 共有三个实验室从小鼠 ES 得到配 子样细胞, 体外能产生雄性原始生殖细胞和单倍体 的雄性配子, 在某种程度上表现出具有配子的功能, 即单倍体基因组和印迹的去除, 当注入到卵母细胞 中, 可恢复体细胞的二倍体染色体构成并发育为囊 胚 1 5。这些研究改变了人们对生育的传统概念, 对生育治疗的前沿研究以及发展新的生殖工程学提 供了开创性思路。 ES 参与个体发育, 理论上可形成包括生殖系统 在内的各种类型细胞, 并对正常发育信号发生反应。 本文将在干细胞 ni
6、che (译为小生境或微环境) 和基 因调节两方面, 对 ES 体外向生殖细胞分化的最新 研究进展作一综述。 一、 小生境在 ES 体外形成生殖细胞中的重要 性 虽然利用 mES 在体外已获得配子样细胞, 但这 三项研究都是采用 ES 建立一个原始生殖细胞 (pri- mordial germ cells, PGCs) 样细胞群, 体外扩增或植 入睾丸, 建立分化的雄性或雌性配子 1 3。而对其 分化过程中基因的调控, 细胞 - 细胞和细胞 - 基质 间相互作用以及诱导信号, 即小生境对 ES 形成拟 胚体, 继而形成 PGCs 并分化为配子细胞等信号传 导机制并不清楚。干细胞通常位于特定小生
7、境中, 即干细胞小生境 (niche) , 小生境中的间质细胞能够 产生一系列生长因子或配体, 与干细胞相互作用, 调 控其更新和分化 6。干细胞分化与小生境密切相 关, 其可能的机制是干细胞进入新的小生境后, 对分 化信号的反应, 受到周围正在进行分化的细胞影响, * 国家自然科学基金资助课题 (30471728) 通讯作者 71生理科学进展 2006 年第 37 卷第 1 期 从而对新的调节信号做出反应。研究证明, 小生境 在决定干细胞命运方面比干细胞自身还要重要, ES 分化并替代所有组织器官中的损伤细胞 只要把 它们放到这个器官的小生境中。 细胞微环境的重要组成之一是细胞外基质 (ex
8、- tracellular matrix,ECM) , 由糖蛋白、 蛋白多糖和胶 原构成, 它们被分泌并储存在细胞粘附所在的组织 网络中。哺乳动物胚胎两细胞阶段时就已产生 ECM, 虽然其构成和细胞与其之间的空间联系在不 同组织内是不同的, 但却是所有类型细胞的小生境 组成成分, 实验显示胚胎的正常发育需要细胞 - 基 质之间反应。ES 和 PGCs 位于发育胚胎的特定小生 境中, 能感受分化信号并决定向生殖系方向分化, 而 不是向体细胞系分化。这种分化信号和细胞所在的 小生境对生殖系定向分化有重要指导作用。 (一) 体内生殖细胞的分化 人类大约在受精 后 8 9 天, 小鼠在 E4. 5,
9、球形的胚胎植入到子宫壁 内。此时人类胚胎的内细胞团 (ICM) 在这个阶段分 成两层, 一个称为下胚层 (hypoblast) , 靠近囊胚腔, 形成原始内胚层, 以后将分化为卵黄囊的外层; 另外 一层称为上胚层 (epiblast) , 将来发育为胚胎所有的 细胞, 可作为一组细胞代替 ICM。因此胚胎在这个 发生阶段, 唯一的多能细胞就是未分化的上胚层细 胞。然而目前最新观点认为, ES 既不与上胚层细胞 相似, 也不与 ICM 或原始外胚层细胞类似, 而是与 早期生殖细胞最为接近 7。人类发育到第三周时 上胚层细胞开始分化, 在第三周末将产生胚胎的三 个原始胚层, 内胚层、 中胚层和外胚
10、层。当发育到第 四周时 PGCs 出现, PGCs 是所鉴定出的生殖细胞最 早启动细胞。生殖细胞在近端上胚层特化, 对来自 临近的胚外外胚层发出的信号发生反应, 特别是 BMP4 8。近端上胚层不是只注定分化为生殖细胞, 因为远端上胚层植入并接触胚外外胚层, 也可引起 生殖细胞形成, 而且近端上胚层细胞最终可形成生 殖细胞和胚外中胚层。因此, 胚外外胚层很可能为 上胚层中生殖细胞特化提供了第一信号, 然后第二 信号作为非特异性信号区别胚外中胚层和生殖细胞 (Tam 等. 1996) 。这也说明胚外外胚层作为特定的 小生境对生殖细胞特化起重要作用。胚胎五周龄时 PGCs 开始迁移, 至六周龄时,
11、 几乎所有 PGCs 迁移 并聚集于生殖腺。对于雄性生殖细胞而言, PGCs 定 向分化为精子之前有以下几个阶段: 分别称之为移 行前 PGCs、 移行后 PGCs、 性腺细胞 gonocytes、 A 型 精原细胞 (A spermatogonia) 、 生殖干细胞 (germ stem cells,GSCs) 和减数分裂前生殖细胞。A 型精原细 胞经过多个特异性细胞分裂阶段 A1 A4 分化为精 母细胞, 继续减数分裂成为精子细胞, 后者完成最后 的分化阶段成为精子。 (二) ES 和 PGCs 与小生境中分化信号 ES 细 胞体外向生殖系分化时, 分泌因子和细胞外基质及 受体起重要作用。
12、 1. 分泌因子: 有两类因子在不同组织甚至不同 种属中都发挥重要作用, 它们是 TGF- 家族和 Wnt (一组编码调节胚胎发育的分泌蛋白质, 由 wingless 和 Int 而得名) 信号通路。TGF- 超家族中的 BMPs 成员在生殖细胞分化中具有重要作用。 PGCs 特化包括了 TGF- 超家族成员 BMPs 的 协同作用。此家族成员之一的 BMP4 由胚外中胚层 细胞产生, 也可由支持细胞产生, 与 PGCs 形成密切 相关 9。BMP4 通过存在于 PGCs 和卵原细胞上的 Alk3 和 R-Smad 受体指导早期上胚层细胞获得生殖 系的能力 9, 10。因此当 BMP4 加入到
13、 ES 和 GSC 培 养中, 可促进生殖细胞的分化发育 1 3。BMP4 对 于小鼠胚胎 PGCs 产生具有重要作用, BMP4-/ -纯合 体胚胎内缺乏 PGCs, 而且杂合体胚胎内的 PGCs 数 量也少于正常胚胎 (Lawson 等. 1999) 。以上研究 说明体内和体外特定的小生境, 诱导信号 (BMP4) 可使 ES 形成 PGCs 或 PGCs 发生分化形成生殖细 胞。 除外 TGF- 超家族成员, 其他因子在生殖细胞 分化过程中也具有重要作用。Schuldiner 等对 8 种 因子在 hES 分化过程中的作用进行研究, 包括 bF- GF、 TGF-1、 activin-A
14、、 BMP4、 HGF、 EGF、 -NGF 和 RA (retinoic acid) (Schuldiner 等. 2000) 。发现 hES 形成拟胚体时表达这些因子的受体, 每种生长因子 具有各自特殊的效应, 可引起直接分化和/ 或细胞的 筛选。这些因子分成三种: 生长因子 TGF-1 和 ac- tivin-A 主要诱导中胚层细胞; 因子 RA、 EGF、 BMP4 和 bFGF 可活化外胚层和中胚层分化标志; NGF 和 HGF 对三个胚层细胞 (包括内胚层) 都有作用。 2. 整合素 (integrin) 与细胞外基质 (ECM) : 果蝇 体内发现两种蛋白质钙粘蛋白和 -连环蛋白
15、 (- catenin) , 在小生境中的生殖细胞和帽细胞结合点大 量积聚, 从生殖干细胞中除去这些蛋白, 干细胞就消 失。提示小生境中的各种基质成分对维持干细胞的 生物学特性极其重要。整合素家族是介导干细胞与 ECM 粘附的最主要分子, 整合素与其配体的相互作 用为干细胞的非分化增殖提供了适当的小生境, 例 81生理科学进展 2006 年第 37 卷第 1 期 如当 1 整合素丧失功能时, 上皮干细胞逃脱微环 境制约而分化成角质细胞。此外, ECM 通过调节 1 整合素的表达和激活, 从而影响干细胞的分布和 分化方向。 (1) ECM 与生殖细胞分化: ECM 调节细胞生物 学行为主要包括三
16、方面: 首先是 ECM 成分的调节; 其次是生长因子和基质分子之间的协同作用; 第三 是通过细胞表面受体介导细胞与 ECM 成分的粘附。 ECM 成分主要包括层粘连蛋白 LN (laminin) , 纤维连接蛋白 FN (fibronectin) 和胶原等, 是干细胞 赖以传递和接受信息的物质基础, 可介导细胞与基 质间的粘附, 诱导细胞分化、 生长、 迁移和聚集等, 参 与胚胎发育与组织发生的全过程。有报道证实, 小 鼠胚胎两细胞阶段时即可表达主要的 ECM 成分及 ECM 受体 (Sutherland 等. 1993) 。Larson 等发现 FN 不仅有促粘附作用, 而且有生长因子样作用
17、, 体外培 养的牛胚中加入外源性 FN, 可促进早胚的卵裂, LN 和 FN 在胚泡细胞表面呈阳性或强阳性着色, 提示 LN 和 FN 参与胚泡形成过程的调节 (Larson 等. 1992) 。 干细胞与基底膜密切相关, 其中骨髓干细胞与 FN 具有亲和性, 角化细胞和迁移后 PGCs 分别与 IV 型胶原和 LN 有亲和性 (Williams 等. 1991,Garca- Castro 等. 1997) 。睾丸细胞分析显示, 精原干细胞 更倾向粘附于 LN, 而不是 IV 型胶原或 FN。胎儿发 育早期的 PGCs 从尿囊基底部迁移进入生殖嵴, 这 个过程依赖迁移路线中的 LN 和 FN,
18、 表现为迁移过 程中粘附性发生改变, 在后期对 LN 粘附最为强烈 (Garca-Castro 等. 1997) 。 以上这些实验说明, ECM 在胚胎发育和生殖细 胞分化过程中具有重要作用。对于 ECM 和生长因 子的协同作用, TGF- 超家族中的 BMPs 成员对诱 导 PGCs 产生就是最好的实例。ES 在体内和体外分 化形成 PGCs 并进一步分化为配子过程中, 如何与 ECM 相互作用共同调控生殖系的发育仍需深入研 究。 (2) 整合素与生殖细胞分化: 精原干细胞对 LN 的粘附说明整合素参与生殖细胞的分化发育过程。 ECM 发挥生物学作用需要与其受体结合, 将小生境 中的信号进一
19、步传递给细胞, 使细胞接受指令发生 分化或增殖。ECM 受体主要有两类, 非整合素受体 和整合素受体, 其中整合素是介导干细胞与细胞外 基质粘附的最主要分子。 目前研究显示, 精原干细胞属于表达 1 整合 素的干细胞行列, 因为这些分子对于干细胞和 LN 结合具有重要性 (Hynes 等. 1992) 。有趣的是, 6 和 1 整合素在早期雌性 PGCs 中表达, 持续出现在 卵母细胞表面, 并在受精过程中参与卵细胞 - 精子 融合 (Zuccotti 等. 1998) 。已有研究证明哺乳动物 卵及精子均存在特定的整合素亚型和配体, 说明该 系统参与精卵间的相互作用。因此可推测 ES 向生 殖
20、系方向分化, 整合素可能参与并发生表达或构型 改变; ECM 可能通过调节 1 整合素的表达和激活, 调节基底膜成分的变化和干细胞小生境中分泌因子 的浓度, 从而影响干细胞的分布和分化方向; ES 分 化为 PGCs 或配子形成可能与整合素发生改变有 关。 3. 小生境与干细胞生物学特性的维持: 生长因 子或诱导信号和 ECM 蛋白, 在细胞小生境内彼此协 调, 调节分化和增生, 这一结论最初是研究干细胞而 得出的。因此研究小生境与干细胞之间的通讯机 制, 对探讨干细胞分化至为重要。对干细胞如何被 吸引并最终定位于小生境进行深入研究, 人们就可 以更好地估测干细胞的结构、 功能和维持机制。大
21、量实验证明, 在体外特定的小生境内, 不同的基质蛋 白, 不同的外源性因子/ 诱导信号, 细胞-细胞之间的 直接反应, 可溶性生长因子-受体以及细胞-基质蛋 白-整合素受体之间的反应, 均对细胞的生长、 迁移、 增殖和分化起着非常重要的作用。 二、 ES 体外向生殖细胞分化的基因调控 大多数动物生殖细胞经历两个复杂并完全不同 的发育阶段。第一阶段, 在胚胎发生早期 PGCs 形 成然后活化并迁移到性腺原基; 第二阶段, 生殖细胞 从其小生境中感应适当信号, 并启动两个调控细胞 分裂、 减数分裂和卵子或精子发生分化程序中的一 个程序形成配子。配子生成和早期生殖细胞发育的 分子基础, 在果蝇和新小
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