介导人血红素加氧酶1基因的重组腺相关病毒载体的构建.pdf
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1、书书书 第2 7卷 第1期 2 0 0 6年1月 武汉大学学报 ( 医学版) M e d i c a l J o u r n a l o fWu h a nU n i v e r s i t y V o l . 2 7N o . 1 J a n,2 0 0 6 课题来源: 国家自然科学基金项目( 编号:3 0 4 7 1 6 5 8) ; 湖北省自然科学基金项目( 编号:2 0 0 4 A B B 1 6 2) 作者简介: 何祥虎, 男,1 9 7 8 -, 医学硕士生, 主要从事麻醉与循环基础和临床研究 通讯作者: 王焱林, 男,1 9 5 1 -, 教授, 博士生导师, 主要从事麻醉与循环
2、基础和临床研究 介导人血红素加氧酶- 1基因的重组腺 相关病毒载体的构建 何祥虎 王焱林 王成夭 李 娜 代 乐 武汉大学中南医院麻醉科 武汉 4 3 0 0 7 1 摘要 目的: 构建含人血红素加氧酶- 1(h HO - 1) 基因的重组腺相关病毒(AAV) 载体并进行鉴定。方法: 利用 基因重组技术, 采用限制性内切酶H i n d从质粒XM - 6/h HO - 1中将目的基因h HO - 1基因片段切出, 克隆到质粒 P AAV - MC S的H i n d位点中, 构建重组质粒p AAV - h HO - 1,采用限制性内切酶酶切,P C R和D NA测序鉴定。 结果:P C R扩增
3、出13 1 7b p大小的片段, 酶切鉴定证实插入位点及方向与预期的完全一致; 测序证实h HO - 1与 G e n eB a n k提供的原始序列完全一致。结论: 成功构建了含h HO - 1基因的重组腺相关病毒载体, 为缺血性疾病基 因治疗的研究奠定了基础。 关键词 血红素加氧酶- 1; 腺相关病毒; 载体构建 中图分类号 Q 7 5 6 文献标识码 A 文章编号 1 6 7 1 - 8 8 5 2(2 0 0 6)0 1 - 0 0 0 1 - 0 4 C o n s t r u c t i o no fA d e n o - a s s o c i a t e dV i r u sV
4、 e c t o rM e d i a t e d G e n eT r a n s f e ro fh H O - 1 H EX i a n g h u,WA N GY a n l i n,WA N GC h e n g y a o,L IN a,D A IL e D e p t.o fA n e s t h e s i o l o g y,Z h o n g n a nH o s p i t a l o fWu h a nU n i v e r s i t y,Wu h a n4 3 0 0 7 1,C h i n a A b s t r a c t O b j e c t i v e:T
5、 oc o n s t r u c ta n di d e n t i f yr e c o m b i n a n ta d e n o - a s s o c i a t e dv i r u s(r AAV)v e c t o rc a r - r y i n gh HO - 1g e n e .M e t h o d s:B yg e n er e c o m b i n a n tt e c h n i q u e,t h ep l a s m i do fXM - 6/h HO - 1w a s d i g e s t e dw i t hH i n d. T h e n t h
6、eh HO - 1g e n e f r a g m e n tw a s c l o n e d i n t op l a s m i dP AAV - MC S t oc o n - s t r u c t t h er e c o m b i n a n tp AAV - h HO - 1p l a s m i d . p AAV - h HO - 1w a sv e r i f i e db yP C R,r e s t r i c t i o n d i g e s t i o na n dD NAs e q u e n c i n g .R e s u l t s:I d e n
7、t i f i c a t i o no fp AAV - h HO - 1b yr e s t r i c t i o nd i g e s t i o n a n dP C Rs h o w e dt h a t t h e l e n g t h,i n s e r t e dl o c a t i o na n dd i r e c t i o no f t h e t a r g e tg e n ew h i c hw a s i n - s e r t e d i n t oP AAV - MC Sw a sc o r r e c t;t h es e q u e n c eo
8、ft h et a r g e tg e n eb yD NAs e q u e n c i n gw a s i - d e n t i c a lw i t ht h a to fN C B IG e n eB a n k. C o n c l u s i o n:p AAV - h HO - 1w a ss u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d . T h ed e v e l o p m e n to fp AAV - h HO - 1w i l lp r o v i d ean e w m e t h o df o rr e s e a
9、 r c ha n dt h e r a p yo f i s c h e - m i cd i s e a s e . K e yW o r d s H e m eO x y g e n a s e - 1;A d e n o - A s s o c i a t e dV i r u s;V e c t o rC o n s t r u c t 缺血再灌注损伤(I s c h e m i a - r e p e r f u s i o ni n j u r y, I R I) 不仅存在于心脏大血管手术中, 而且在高血压、 冠心病、 脑血管疾病中也时有发生。大量的研究结 果表明, 自由基损伤是
10、导致I R I的一个非常重要的 原因, 而抗氧化剂则有预防和治疗I R I的作用。血 红素加氧酶(H e m eo x y g e n a s e,HO) 是血红素降解 武汉大学学报( 医学版)第2 7卷 的起始酶和限速酶, 其产物胆绿素( 胆红素) 和一氧 化碳(C O) 分别具有抗氧化损伤和调节血管等作 用 1 - 3。而 腺 相 关 病 毒 ( a d e n o - a s s o c i a t e d v i r u s, AAV) 是D NA缺陷性小病毒, 能有效转染分裂和非 分裂性细胞, 转染效率高, 并能长期有效表达外源基 因, 为基因的表达提供了一个理想的真核表达载体 系统
11、。因此, 本研究拟包装含h HO - 1基因的重组腺 相关病毒, 为下一步进行缺血性疾病的研究奠定基 础。 1 材料与方法 1. 1 材料 1. 1. 1 质粒和腺相关病毒载体 质粒XM - 6 /h HO - 1由 首 都 医 科 大 学 安 威 教 授 惠 赠。质 粒P AAV - MC S来源于AAV H e l p e r - f r e es y s t e m, 购自S t r a t a - g e n e。大肠杆菌E. c o l iDH - 5 由武汉大学医学院 病毒学研究所赠送。 1. 1. 2 仪器和试剂 各种限制性内切酶、 T a q D NA 聚合酶、 d NT P
12、s、1k bD NA M a k e r和碱性磷酸酶均 购自MB IF e r m e n t;T 4 D NA连接酶购自P r o m e g a 公司; 低熔点琼脂糖购自B i o w e s t; 凝胶图像分析系 统( 为上海培清科技有限公司产品) 。 1. 2 方法 1. 2. 1 目的基因片段h HO - 1的获得 将含h HO - 1 的XM - 6/h HO - 1质粒转化到E. c o l iDH - 5 感受态 细菌, 接种于含氨苄青霉素的L B培养基平板上培 养, 于3 7孵箱过夜, 挑取单菌落, 于3 7 以2 0 0 - 2 5 0r/m i n振荡培养过夜, 碱裂解法
13、提取质粒。用限 制性内切酶H i n d单酶从XM - 6/h HO - 1质粒上将 h HO - 1基因片段切出, 经1. 0%的琼脂糖凝胶电泳 鉴定, h HO - 1基因片段为9 8 7b p。取用H i n d酶 切的h HO - 1片段进行1. 0%的低熔点琼脂糖凝胶电 泳, 在紫外灯下将含有所需D NA片段的凝胶块切 下, 于7 0 熔 化 回 收,置p H 8. 0 T E缓 冲 液 中, -2 0保存。 1. 2. 2 载体P AAV - MC S的线性化 质粒P AAV - MC S转化到E.c o l iDH - 5 感受态细菌, 接种于含 氨苄青霉素的L B培养基平板上培
14、养, 于3 7 孵箱 过夜, 挑取单菌落, 于3 7以2 0 0 - 2 5 0r/m i n振荡培 养过夜, 碱裂解法提取质粒。用限制性内切酶H i n d 单 酶 切, 并 用 碱 性 磷 酸 酶 去 磷 酸 化, 溶 于 p H 8. 0 T E2缓冲液中,-2 0保存。取少量酶切产物在 1. 0%的琼脂糖凝胶上电泳, 观察酶切情况。 1. 2. 3 目的基因h HO - 1和线性化载体的连接 将 载体和外源片段按1“3( 摩尔数比) 的量选取。取前 面酶切保存的h HO - 1基因片段为外源片段, 碱性磷 酸酶处理的线性化的P AAV - MC S片段为载体, 在 T 4 D NA连接
15、酶作用下于1 6 进行连接反应1 6h, 再转化到E. c o l iDH - 5 感受态细菌, 涂布于含氨苄 青霉素的L B培养基平板上培养, 于3 7孵箱过夜。 1. 2. 4 重组质粒的筛选和鉴定 用牙签挑取上述 过夜培养的单菌落, 于3 7 以2 0 0 - 2 5 0r/m i n振荡 培养过夜, 碱裂解法快速提取质粒。所得质粒D NA 先用1. 0%的琼脂糖凝胶电泳初筛, 选出分子量大于 空载体的质粒进一步作P C R和酶切鉴定。P C R鉴 定: 依据P AAV - MC S的多克隆位点上下游- g l o b i n 和h GHp o l y A通用引物序列合成引物:F o r
16、 w a r d( - g l o b i n) :5 - AT T C T GAG T C C AAG C TAG G C - 3 ; R e v e r s e(h GHp o l y A) :5 - TAGAAG GA C A C - C TAG T C AGA - 3 在5 0l体系中1 0b u f f e r5l, 5 0 mm o l/L M g C l6l,1 0 mm o l/L d NT P 5l, p r i m e r 1(11 0 -8 m o l/L)1l,p r i m e r2(11 0 -8 m o l/L)1l, T a q 酶2l( 2U) ,1l重组质粒
17、,2 9l 的d d H2O 扩增, 反应条件为9 42m i n预变性, 9 4 3 0s,5 63 0s,7 22m i n,3 0个循环,7 2 1 0 m i n延伸, 产物在1%琼脂糖凝胶中电泳, 检测是否 扩增出目的片段。将P C R鉴定证明含有目的片段的 质粒用酶切鉴定: 用限制性内切酶H i n d鉴定是否 确有9 8 7b ph HO - 1的目的片段插入, 再用B a mH 和A p a鉴定目的片段插入的正反方向。筛选出含 目的片段并且正向插入的重组质粒命名为p AAV - h HO - 1(+) 。将重组质粒p AAV - h HO - 1(+) 送上 海基康生物技术有限
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- 关 键 词:
- 介导人 血红素 加氧酶 基因 重组 相关 病毒 载体 构建
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