人角膜上皮干细胞的识别.pdf
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1、书书书 论著 作者单位: 300070 天津医科大学眼科中心 通讯作者: 孙慧敏, Email: iiitc eyou. com 人角膜上皮干细胞的识别 陈卓 孙慧敏 苑晓勇 【摘要】 目的 探讨人角膜上皮干细胞的分子标记。方法 对人角膜和角膜缘部位行组织学 检查以分析角膜缘解剖结构。对人角膜切片和整个角膜组织行免疫组织化学染色以检测中央角膜和 角膜缘部位未分化标记, 如核蛋白 p63、 乳腺癌抵抗蛋白 (ABCG2, BCRP1) 、 烯醇化酶 、 整合素 6、 9 及 1、 表皮生长因子受体 (EGFR) 、 细胞角蛋白 19 (CK19) 、 14 (CK14) 及转铁蛋白受体 (CD7
2、1) 的表 达,经荧光显微镜和激光扫描共焦显微镜观察。对角膜中部和角膜缘上皮细胞的 mRNA 进行半定量 逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 和原位杂交以检测其相关基因的表达。结果 角膜缘部位横向切片 显示角膜缘上皮细胞为乳头放射状排列, 对应于 Vogt 栅栏环境。未分化标记整合素 1、 EGFR、 烯醇 化酶 及 CK19 在角膜缘基底细胞胞质染色较表层细胞更强;p63、 ABCG2、整合素 9 蛋白仅见于角 膜缘基底部上皮细胞。激光扫描共焦显微镜观察和 RT-PCR 结果显示角膜缘表达 p63、 ABCG2、整合 素 9 蛋白及 mRNA。原位杂交显示 p63 仅表达于角膜缘基底层细胞
3、。结论 角膜缘上皮呈乳头放 射状排列, 角膜缘干细胞群具有复合标记:p63 表达于细胞核、 ABCG2 表达于胞质、 整合素 9 表达于 胞膜。采用这些标记复合体, 可将角膜缘干细胞群与其他上皮细胞区分。 (中华眼科杂志,2005, 41: 1014-1019) 【关键词】 上皮, 角膜; 干细胞; 角膜缘; 免疫组织化学; 生物学标记 Identification of human corneal epithelial stem cells CHEN Zhuo,SUN Hui-min,YUAN Xiao-yong. Tianjin Medical University Eye Centre,
4、Tianjin 300070,China Corresponding author:SUN Hui-min,Email:iiitcJ eyou. com 【Abstract】 Objective To investigate the molecular markers of corneal epithelial stem cells. Methods The anatomy structure of corneal limbus was analyzed by histological examination. Fluorescence microscopy and laser scan co
5、nfocal microscopy( LSCM) were used to evaluate the expression of undifferentiation markers as p63,ABCG2,6,9 and 1 integrin,-enolase,EGFR,cytokeratin 19 (CK19)and CD71 in cornea-limbus sections and whole mount cornea tissue using immunohistochemistry staining. Semiquantitative RT-PCR and in situ hybr
6、idization (ISH)were used to evaluate gene expression of corneal and limbal epithelia.Results The limbal area in horizontal cut direction showed that limbal epithelial cells were as papilloma-form to correspond to the Palisades of Vogt environment. The expressions of 1 integrin,K19,-enolase and EGFR
7、were much stronger in limbal basal cells than superficial cells. Undifferentiation markers p63,ABCG2,9 integrin were detected only in the basal limbal epithelial cells. LSCM and RT-PCR results showed that the protein and mRNA of p63,ABCG2 and 9 integrin were only detected in limbal epithelia. ISH sh
8、owed that p63 mRNA only expressed in the limbal basal epithelial layer. Conclusions The corneal limbal epithelial area is papilloma-form. Limbal stem cells have complex markers as p63 expressing in the nuclei,ABCG2 in the cytoplasm and 9 integrin expressing in the membrane. With these markers comple
9、x,it is easy to distinguish limbal stem cells from other epithelial cells in cornea. (Chin J Ophthalmol ,2005, 41: 1014-1019 ) 【Key words】 Epithelium, corneal; Stem cells; Limbus corneae; Immunohistochemistry; Biological markers 组织特异性干细胞对保持整个躯体组织包括眼 组织的完整性起着关键的作用。角膜上皮干细胞位 于角膜缘 1的证据是: (1) 角膜缘基底细胞缺乏角
10、膜上皮细胞分化相关角蛋白组合 CK (cytokeratin) 3 和 CK12 2; (2) 角膜缘基底上皮细胞具有增殖的特 性, 用 DNA 前 体3H胸 苷 或 溴 脱 氧 尿 核 苷 (BrdU) 3示踪标记显示其细胞周期长3; (3) 角膜 缘上皮细胞部分或全部缺损后, 角膜上皮出现异常 的伤口愈合, 如结膜化、 角膜化和慢性炎性反应 4; (4) 角膜缘肿瘤相对较多, 而角膜上皮肿瘤较少 5; (5) 角膜缘细胞已用于角膜缘干细胞缺乏患者引起 4101中华眼科杂志 2005 年 11 月第 41 卷第 11 期 Chin J Ophthalmol, November 2005,Vo
11、l 41,No. 11 表 1 引物的序列及其产物长度 基因来源*顺向引物反向引物PCR 产物 (bp) 核蛋白 p63XM-036421CAGACTCAATTTAGTGAGAGCTCATGGTTGGGGCAC440 ABCG2AY017168AGTTCCATGGCACTGGCCATATCAGGTAGGCAATTGTGAGG379 整合素 9NM-002207TGGATCATCGCCATCAGTTTGCCGGTTCTTCTCAGCTTCGAT123 GAPDH 内对照M33197GCCAAGGTCATCCATGACAACGTCCACCACCCTGTTGCTGTA498 注: *来源为该基因在基
12、因库中序号 角膜上皮部分或全部缺损的角膜重建 6。这些证 据有力支持角膜上皮干细胞位于角膜缘部位, 但仍 无直接识别角膜缘干细胞的特异标记物。 目前提出的上皮组织干细胞主要标记可分为 3 组:(1) 细胞黏附成分: 整合素、 表皮生长因子受体 (Epidermal growth factor receptor, EGFR) ;(2) 胞质 内 CK19、 烯醇化酶 、 乳腺癌抵抗蛋白 ABCG2;(3) 核蛋白 p63。 本研究采用离体角膜组织检测上述提出的标记 以确定角膜上皮干细胞,旨在完整地分析角膜干细 胞标记; 应用这些标记, 将干细胞与其他细胞分开。 材料和方法 一、 人角膜和角膜缘组
13、织的制备 正常人角膜和角膜缘组织取自德克萨斯狮子会 眼库。将组织经包埋浸入液氮后行 10 m 冰冻切 片。沿纵向切穿角膜中心, 或沿横向切过角膜边缘。 对其行苏木素-伊红 (HE) 染色和免疫组织化学染 色。将人角膜缘组织浸入 10% 甲醛磷酸盐缓冲液 中 1 2 d, 转移至 70% 乙醇, 脱水, 石蜡包埋, 制备 5 m切片。石蜡切片用于免疫组织化学染色及原 位杂交。 二、 角膜上皮细胞 mRNA 的提取与逆转录聚合 酶 链 反 应( reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR) 采用保存时间短于 36 h 的新鲜角膜。用
14、直径 为 8 mm 的环钻将中间角膜和角膜缘分开, 刮下角 膜和角膜缘上皮细胞并置于 4 mol/ L 呱乙锭中。用 硫氰酸盐呱乙锭-苯酚-氯仿法萃取 mRNA。定量 mRNA 浓度后 -80保存。以三磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH) 基因为内对照, 用半定量 RT-PCR 法对角 膜和角膜缘上皮 mRNA 的不同分子标记进行分析。 取 0. 5 g 的 mRNA 经逆转录酶 ( 美国 Applied Biosystems 公司) 转录后, 用不同的引物 (表 1) 进行 PCR 扩增。在 PCR 第 20、24、28、 32、36、40 周期 时取标本检查结果绘制曲线。 三、 免疫荧光染色
15、人角膜缘冰冻切片行免疫荧光染色, 经解冻、 脱 水, 固定于甲醇或 2% 多聚甲醛 10 min 后漂洗。先 将切片置入 5%正常山羊血清的缓冲液封闭 1 h 以 减少非特异性抗体的结合, 该溶液也用于稀释抗体。 加入单克隆抗体: 整合素 1 (1: 200, 美国 LabVision 公司) 、 整合素 6 (1: 200, 美国 Sigma 公司) 、 核蛋白 p63 (1: 1000, 美国 LabVision 公司) 、 EGFR (1: 20, 美 国 LabVision 公司) 、 CD71 (1: 200, 美国 LabVison 公 司) 、 CK19 (1: 300, 美国
16、DAKO 公司) 、 CK14 (1: 100, 美国 ICN Pharmaceuticals 公司) ; 多克隆抗体抗大鼠 ABCG2(1: 100, 美国 Calbiochem 公司) 、 山羊烯醇化 酶 (1: 100, 美国 Santa Cruz Biotechnology 公司)及 兔整 合 素 9( 1 : 200,美 国 George Washington University Medical Center, Stepp M. 教授惠赠) , 室温 下1 h。缓冲液漂洗后, 加入二抗山羊抗鼠、 抗大鼠、 抗兔 及 猴 抗 山 羊 Alexa Fluor488(1 : 200, 美
17、 国 Molecular Probes 公司) 室温下 1 h 后缓冲液漂洗。 全部切片用 DNA 结合荧光染料 Hochest33342 做对 照染色后盖片于数码显微系统 (model DMX 1200, 日本 Nikon 公司) 观察照相。 四、 免疫组织化学染色 用免疫组织化学法对 p63、 ABCG2 及整合素 9 在角膜缘的表达进行检测。石蜡切片脱蜡、 脱水后, 5%正常山羊血清的缓冲液封闭 1 h, 加入单克隆抗 体 p63 (1: 1000) 、 多克隆抗体 ABCG2(1: 100)及整 合素 9 (1: 100) , 4过夜。缓冲液漂洗后, 生物素 化抗鼠 IgG 抗体与辣根
18、过氧化物酶结合,3, 3-二氨 基联苯胺 DAB 显色, 产生棕色沉淀为阳性。 五、 角膜全组织免疫荧光染色与激光扫描共焦 显微镜观察 新鲜角膜全组织经 2% 多聚甲醛固定 10 min 后, 缓冲液漂洗多次, 含 20% 正常山羊血清的缓冲 液封闭 2 h, 加入鼠单克隆抗体 p63 (1: 1000) , 多克 隆抗体 ABCG2(1: 100) 、山羊烯醇化酶 (1: 50) 或整合素9 (1: 100) , 4过夜。 缓冲液漂洗后, 分 5101中华眼科杂志 2005 年 11 月第 41 卷第 11 期 Chin J Ophthalmol, November 2005,Vol 41,
19、No. 11 表 2 角膜和角膜缘上皮细胞的标记情况 标记p63ABCG2整合素 9整合素 1EGFRCK19烯醇化酶 CD71整合素 6 角膜表层-+ + + + + + + 角膜基底-+ + + + + + + + + + + 角膜缘表层+ + + + + + 角膜缘基底+ + + + + + + + + + + + + + + + +- 别加入二抗山羊抗鼠、 抗大鼠、 抗兔及猴抗山羊 Alexa Fluor488 (1: 200, 美国 Molecular Probes 公司) 室温下 1 h 后缓冲液漂洗。 全部切片用碘化丙啶 (propidium iodide, PI)做 对照染色后
20、盖片于激光扫描共焦显微镜 (LSM 510, Zeissw/ Krypton-argonandHe-Nelaser,美 国 Thornwood 公司) 下观察照相。激光发射波长分别 为 488 nm 和 543 nm,滤光片分别为 LP505 和 LP560。图像放大 400 倍后记录, 经 Zeiss 激光扫描 共焦显微镜和 Adobe Photoshop 6. 0 软件处理。 六、 原位杂交 p63-PBSK 质粒经限制性内切酶 SmaI 消化, 线 性化后经 Sp6 RNA 聚合酶 (美国 Promega 公司) 合 成反义探针, 限制性内切酶 XbaI 消化与 T7RNA 聚 合酶 (
21、美国 Promega 公司) 生成正义探针。线状质粒 胶分离, 用作模板以制备正义和反义 35S UTP 标记 的核酸探针 (美国 Amersham Parmacia 公司) , 转录 混合物在 37进行至少 2 h 转录, 消化、 纯化、 沉淀 后以 50 l 二乙焦炭酸盐 (DEPC) 水重悬。 5 m 石蜡切片脱蜡再水化, 10% 甲醛-磷酸盐 缓冲液固定和蛋白酶消化后, 切片于杂交混合物中 60预杂交 1 h。探针 100变性 5 min, 然后加入 到杂交复合物中, 60 杂交过夜。漂洗切片多次。 RNA 酶 A 消化后再次漂洗; 干燥后, 切片置于照相 乳剂 14 d, 显微镜下暗
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