从大容量随机噬菌体抗体库筛选人源性抗酪氨酸酶相关蛋白1抗体.pdf
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1、3 8 8中国皮肤性病学杂志2 0 0 5 年7 月第1 9 卷第7 期 C h i n J D e r m V e n e r e o l , J u l . 2 0 0 5 , V o l . 1 9 , N o . 7 从大容量随机噬菌体抗体库筛选人源性抗酪氨酸酶 相关蛋白1 抗体 李 春英 , 乔 媛媛 2 , 王刚 , 陈宇萍 ”, 高 天文 , 王 攻, 摘要 目的 从大容量随机噬菌体抗体库中筛选人源性杭酪氨酸酶相关蛋白I ( T R P - 1 ) 单链抗体并进行鉴定 及基因刚序分析。方法以原核表达并纯化的T R P - 1 为抗原, 通过“ 吸附一 洗脱一 扩增” 过程从大容量
2、随机噬菌体抗体库中 筛选特异性抗T R P - 1 蛋白的单链抗体, 分别通过E L I S A和基因测序的方法对其杭原结合活性和序列进行分析鉴定。结果 经过4 轮筛选, 获得 1 8 个能与T R P - 1 蛋白结合的阳性克隆, 其中3 个克隆的噬菌体抗体能与T R P - 1 特异性结合; 基因 测序分析表明, 所获抗体分别属于不同的抗体克隆。结论利用噬菌体抗体库技术可以不经免疫过程制备出高特异性的 人源性抗 T R P - 1 抗体。 关键词 酪氛酸酶相关蛋白1 ; 杭体, 单克隆 中图分类号I R 3 9 2 . 1 1 ; R 7 8 2 文献标识码 A 文章编号 1 0 0 1
3、- 7 0 8 9 ( 2 0 0 5 ) 0 7 - 0 3 8 8 - 0 4 C l o n i n g o f H u m a n a n t i - T R P I A n t i b o d i e s F r o m a P h a g e A n t i b o d y L i b r a r y L I C h u n - y i n g , Q I A O Y u a n - y u a n , W A N G G a n g , e t a l ( D e p a r t m e n t o f D e r m a t o l o g y , X ij i n g H o
4、 s p i t a l , F o u t h M i l i t a r y M e d i c a l U n i v e r s i t y , X i a n 7 1 0 0 3 2 , C h i n a ) A b s t r a c t ; O b j e c t i v e T o c l o n e h u m a n p h a g e a n t ib o d i e s a g a i n s t T R P - 1 ( t y r o s i n a s e r e l a t e d p r o t e i n 1 ) f r o m a p h a g e a
5、n t i - b o d y l i b r a ry . Me t h o d s P a n n i n g o f t h e p h a g e a n t i b o d y l i b r a ry a g a i n s t T R P - 1 a n t i g e n w a s c o n d u c t e d t o s e l e c t s p e c i f i c s i n g l e - c h a i n a n t i b o d i e s . T h e a n t i g e n b i n d i n g a c t i v i t y a n
6、 d t h e s p e c i f i c i t y o f t h e i s o l a t e d b i n d e r s w e r e d e t e r m i n e d w i t h E L I S A . R e s u l t s A f t e r 4 r o u n d s o f “ a d h e n s i o n - a m p l i f i c a t i o n - e l u t i o n “ p a n n i n g , 8 c l o n e s o f s c F v w h i c h c o u l d b i n d s p
7、 e c i f i c a l l y t o T R P - 1 w e r e o b t a i n e d . T h e g e n e s o f t h e m t h e n w e r e s e q u e n c e d a n d a n a l y z e d . C o n c l u s i o n I t i s f e a s i b l e t o i s o l a t e h u m a n a n t i - T R P - 1 p h a g e a n t i b o d i e s b y - p a s s i n g i m m u n i
8、 z a t i o n u s i n g p h a g e a n t i b o d y l i b r a ry . K e y w o r d s : T y r o s i n a s e r e l a t e d p r o t e i n I ; A n t i b o d y , m o n o c l o n a l 酪氨酸酶相关蛋白1 ( T R P - 1 ) 是第一个克隆成功 的色素基因, 是黑素细胞中含量最为丰富的糖蛋 白 , 。以 往的 研究表明, T R P - 1 定位于黑素小体膜, 在黑素合成过程中发挥重要作用。近年来人们对 T R P - 1 的功能有
9、了进一步的认识, 诸多实验结果支持 T R P 1 除了参与黑素代谢外, 还影响黑素细胞的生长 和死亡, 因而可能与白瘫风的发生有关。同时, T R P - 1 作为重要的黑素细胞分化抗原, 有可能成为黑素瘤生 物治疗中新的药物作用靶点。 笔者曾经成功地克隆了T R P - 1 基因, 表达并纯化 了T R P - 1 蛋白 。本研究尝试从该大容量随机噬菌 体抗体库中筛选抗 T R P - 1 人抗体, 不仅可以深化对 T R P - 1 功能意义的认识, 同时还可为白瘫风发病机理 和黑素瘤生物治疗的研究奠定基础。 基金项目 国家自 然科学基金( 3 0 3 0 0 3 0 7 ) 作者单位
10、1 第四军医大学西京医院皮肤科, 陕西西安 7 1 0 0 3 2 , * 博士后, 原工作单位同2 ; 2 解放军海军总医院中心实验科, 北京 1 0 0 0 3 7 作者简介 李春英( 1 9 7 5一) , 女, 黑龙江省集贤县人, 讲师, 医学 博士, 主要从事色素性疾病及皮肤肿瘤的研究。 通讯作者 王刚: x j w g a n g f m m u . e d u . c n 1 材料和方法 1 . 1 材料 抗体库及其他主要试剂: 大容量随机噬菌 体抗体库为海军总医院中心实验室提供, 库容 l x l o ll ; 各种内切酶均为P r o m e g a 产品; 大肠杆菌菌株 T
11、 G I , 辅助病毒V C S M 1 3 为本室保存; 纯化的T R P - 1 蛋 白 ( 2 0 0 W m l ) 、 人角 蛋白K 1 7 蛋白 由 本室制 备 3 0 1 . 2 方法 1 . 2 . 1 抗角蛋白噬菌体抗体的筛选以T R P - 1 蛋白 为抗原, 稀释至5 R 梦m l , 固相化至抗原管( I m m u n o - t u b e , N u n c ) , 参照 文献 a 的 方法 对抗体 库进行4 轮“ 吸 附一 洗脱一 扩增” 筛选。每一轮筛选均测定次级库滴度 并计算噬菌体投人/ 产出比( 回收率) , 作为特异性噬 菌体抗体富集的指标。 1 . 2
12、 . 2 噬菌体抗体的制备及检测在筛选的最后一 轮, 从T Y E 盘中分3 批共挑取5 0 个单集落, 在2 x Y T 中培养, 用辅助病毒 V C S M 1 3 超感染诱导培养过夜后 收集上清为噬菌体抗体。以1 . 2 5 t 岁m l T R P - 1 蛋白 包被E L I S A板, 经 1 % B S A封闭后加人待测噬菌体抗 体上清( 1 : 1 稀释) , 以H R P 一 羊抗 M 1 3 为二抗, 孵育、 洗涤后 O P D底物显色; 显色阳性的克隆再以人 T R P - 1 中国皮肤性病学杂志2 0 0 5 年7月第1 9 卷第7 期 C h i n J D e r
13、m V e n e r e o l , J u l . 2 0 0 5 , V o l . 1 9 , N o . 7 3 8 9 蛋白、 人角蛋白K 1 7 , 噬菌体 M 1 3等为抗原同时包被 E L I S A板, 鉴定其抗原抗体反应的特异性。 1 . 2 . 3 抗体可变区基因的P C R扩增与分析 用碱裂 解法提取阳性克隆的质粒, 送公司进行基因序列测定, 测序结果以D N A M A N软件进行分析。 2 结果 2 . 1 抗T R P - 1 噬菌体抗体的筛选 经过4 轮筛选, 得 到噬菌体抗体回收率约1 0 0 0 倍富集。用最后一轮挑 取的5 0个单菌落制备噬菌体抗体, 经
14、 E L I S A检测有 1 8 个显示与T R P - 1 的结合活性, 其中3 个与人角蛋白 K 1 7 、 噬菌体M 1 3 等无关抗原不结合, 具备特异性。表 1 为3 个克隆与各种抗原的E L I S A反应结果。 表1 噬菌体抗体与T R P - 1 蛋白 特异性结合的 E L I S A结果( A 4 9 0 , x 士 s ) 组别 克隆 1 克隆2 克隆3 对照 * TRP- 1 K1 7M1 3 0 . 1 8 2 10 . 0 1 0 0 . 2 4 3 1 0 . 0 0 7 0 . 2 3 4 10 . 0 0 4 0 . 0 2 3士 0 . 0 0 0 0 .
15、0 2 1 10 . 以碎 0 . 0 1 2士 0 . 0 0 0 0 . 0 0 9士 0 . 0 0 1 0. 0 0 2士0 . 0 0 1 0 . 0 3 0士0 . 0 0 2 0 . 0 0 7士0 . 0 0 0 0 . 0 0 6士 0 . 0 0 1 0 . 5 4 4 10 . 0 0 8 * 对照: 抗M 1 3 噬菌体抗体 2 . 2 可变区D N A序列测定对具有T R P - 1 蛋白特异 性结合活性的3 个克隆进行可变区基因序列测定。结 果表明克隆1 , 3 重链均属于人I g G第三亚群, 克隆2 重链为第一亚群; 轻链为 K 链, 均属第一亚群。各克 隆的轻
16、、 重链可变区基因序列见图t o 克隆 1: VH C A GG T G C AG C T G G T GC A G T C T GG GG GAG GC C T GG T C - A A G C C T G G G G G G T C C C T G A G A C T C T C C T G T G C A G C C - T C T G G A TT C A C C TT C A G T A G C T A T A G C A T G G A C T G G G - T C C G C C AGGC T C C AGG G AAGG GGC T GG AG T G GG T C T -
17、C A T C C A TT A GT AG T AG T GG T AC TT AC A T A T AC T AC GC - AG AC T C AG T GAA GGG C C G A TT C AC C A T C T C C AG AG A- C A A C G C C A AG A AC T C A C T G T A T C T G C A A A T G A A C AG- C C T G C G AG C C G AGG AC AC G GC T G T G T A TT AC T G T GC - G A G A G C G G G C C G T A A A G G A
18、A G C T C G G C C G G A A G A T - TT G AC T AC T G GGG C C AGG GA AC C C T G G T C VK A T G T A T AC T GG T AC C AG C AG C T C C C AG G AAC GG C C C - C C A AAC T C C T C A T C T AT AGG AA T A AT C AG C G GC C C T C - AGG GG T C C C T G AC C G A TT C T C T GGC T C C AAG T C T GG C - AC C T C AGC C T
19、 C C C T G GC C AT C AG T GG GC T C C GG T C C G- AG G A T GA GGC T G ATT A TT AC T G T G C AGC AT G GG A T G- AC AG C C T AAA T GG TT A T G T C TT C GG A AC T G GG AC C A- AG C T G AC C G T C C T AG G T 克隆2: VH G AGG T GC AG C T G TT GG AG T C T GGG GC T G AG G T G AAG- AA GC C T GG GG C C T C AG T
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- 关 键 词:
- 容量 随机 噬菌体 抗体 筛选 人源性抗 酪氨酸 相关 蛋白
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