以鼠源重链FD片段为模板导向筛选人源性抗γ精浆蛋白抗体轻链.pdf
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1、论著文章编号: 1007 -8738 (2006) 02 -0196 -04 以鼠源重链 Fd 片段为模板导向筛选人源性抗 -精浆蛋白抗体轻链 张 青1,张思河2,易 静1,苏明权1,包国强3,郝晓柯1* (第四军医大学: 1西京医院检验科,2基础部细胞工程研究中心,陕西 西安 710032,3唐都医院普通外科,陕西 西安 710038 = ) 收稿日期: 2005 -11 -07; 修回日期: 2005 -12 -23 基金项目:国家高技术研究发展计划 (863) 资助项目 (No.2001AA215321) ; 国家十五重大科技专项项目 (No.2002AA2Z3109) 作者简介:张 青
2、 (1973 - ) ,女,安徽庐江人,主管技师,硕士生. *Corresponding author,Tel: (029) 84775959 Screening of human anti-seminopro- tein light chain guided with the murine Fd fragment ZHANG Qing1,ZHANG Si-he2,YI Jing1,SU Ming- quan1,BAO Guo-qiang3,HAO Xiao-ke1* 1Department of Clinical Laboratory,Xijing Hospital,2Cell Eng- i
3、neering Research Centre,Basic School,3Department of general surgery,Tangdu Hospital,Fourth Military Medical University, Xi an 710032,China Abstract AIM:To screen human anti-sm(-sem- inoprotein)Iight chain(Lc)with guided seIection of murine Fd fragment. METHODS:The human Lc repertorie genes were ampI
4、ified by RT-PCR from PBMC in patients with pros- tate cancer,and cIoned into the phagemid vector pComb3X with murine Fd gene against -seminoprotein to construct the human-mouse hybrid Fab antibody Iibrary. The size of the Iibrary,antibody gene recombinant percentage and di- versity were identified b
5、y coIony counting,pIasmid digestion and coIony sequence anaIysis,respectiveIy. Purified -sm was used as antigen to screen the dispIayed phage hybrid antibody Iibrary rescued by heIper phage M13K07 for three rounds. The positive cIones were seIected by ELISA with p -fusion antibody and then the seque
6、nces of Iight gene in the positive cIones were anaIyzed by IMGT-VQuEST. RE- SULTS:A 1.2 107CPu human-mouse Fab antibody Iibrary was constructed with 90% Lc gene recombinant and great diversity. After 3 rounds panning with -sm,5 positive cIones were seIected by ELISA and 2 cIones with higher af- fini
7、ty were seIected.Sequence anaIysis suggested these two positive cIones contained the same Iight gene with high VL homoIogy to human germIine gene IGKV4-1*01. CON- CLUSION:Human anti-sm Iight chain was successfuIIy screened by constructing mouse-human hybrid Fab phage antibody Iibrary with murine Fd-
8、guided seIection. Keywords phage antibody Iibrary; guide seIection; pros- tate cancer 摘 要 目的:以鼠源抗 -sm 抗体重链 Fd 片段为模板,筛 选人源性抗人 -精浆蛋白抗体轻链。方法:利用 RT-PCR 从 前列腺癌患者外周血淋巴细胞扩增出全套的人抗体轻链基 因,克隆入含鼠源性抗 -sm 抗体重链 Fd 片段的噬粒载体 pComb3X/ mFd 中,电转化大肠杆菌 XL1-Blue 后建立人-鼠杂 合的 Fab 抗体库。通过稀释滴定、限制性酶切和随机测序, 对所建杂合库的库容、重组率和多样性分别进行鉴定
9、,以 M13K07 辅助噬菌体超感染,利用亲和纯化的 -sm 为抗原, 对挽救展示的噬菌体抗体库进行 3 轮淘筛和克隆鉴定。最后 对筛选出的杂合抗体进行初步的功能检测。结果:构建成功 1. 2 107CFU、重组率为 90%、多样性好的杂合人 - 鼠噬菌 体抗体库。利用纯化的 -sm 3 轮亲和淘筛后,5 个克隆成功 诱导表达特异性的 pIII 融合抗体。ELISA 进一步检测表明,5 个克隆均呈特异性阳性反应,其中 2 个克隆亲和力较高,测 序显示其所含轻链基因序列完全相同,可变区来源于 IGKV4- 1*01 胚系基因家族。结论:利用鼠源 Fd 片段为模板,导向 筛选杂合噬菌体库,成功筛选
10、到人源性抗人 -精浆蛋白抗体 轻链。 关键词 噬菌体抗体库;导向筛选;前列腺癌 中图分类号 R392. 11 文献标识码 A 我实验室利用杂交瘤技术已制备出特异性抗人 前列腺癌抗原 -精浆蛋白 (-seminoprotein,-sm) 的 单克隆抗体 (mAb) ,并在前列腺癌的实验治疗中显 示出良好的应用前景 1。然而,此鼠源性 mAb 属于 异种蛋白,在人体内可产生不同程度的人抗鼠抗体 反应 (human anti-mouse antibody response,HAMA) , 从而削弱其治疗的有效性,并对清除抗体的器官产 生损害。本实验中拟通过构建人-鼠杂合的噬菌体 Fab 抗体库,以纯
11、化的 -sm 对其进行导向筛选,以 期得到特异性人源性的抗 -sm 抗体的全长轻链。 1 材料和方法 1. 1 材料 大肠杆菌菌株 XL1-Blue、Top10F、辅助噬菌体 M13K07、Taq DNA 聚合酶、Sac I 、Xba I、Spe I、Xho I 限制性 核酸内切酶、T4 DNA 连接酶均购自北京纽英伦生物技术公 691ISSN1007 -8738 细胞与分子免疫学杂志 (Chin J Cell Mol Immunol) 2006, 22 (2) 司。Trizol、RT-PCR(AMV)Kit、PCR 产物纯化 Kit、凝胶 DNA 回收 Kit 与质粒提取 Kit 均购自 P
12、romega 公司。含抗 - sm 鼠源性抗体 E4B7Fd 基因的 Bluescript KS/ Fd 质粒及纯化 的人 -sm 为本室制备 2。噬粒载体 pComb3X 购自美国加州 Scripps 研究所。HRP-羊抗人 IgG (H + L) 抗体、PEG8000、 IPTG、各种抗生素均购自晶美公司。引物合成及测序由大连 TaKaRa 公司完成。PCR 仪、电穿孔仪、Model-680 酶标仪均 为美国 Bio-Rad 公司产品。糖元、淋巴细胞分离液及其他常 规生化试剂均为上海试剂二厂产品。 1. 2 方法 1. 2. 1 人抗体全套 Lc 基因的 PCR 扩增 收集 15 例前列腺
13、 癌患者 (均为本校西京医院、唐都医院住院患者,并经病理证 实) 的新鲜外周血共30 mL, 应用淋巴细胞分离液提取 PBMC。 Trizol 法裂解细胞,氯仿-异丙醇-无水乙醇法提取总 RNA,用 紫外分光法和快速 RNA 凝胶电泳做定量和定性分析。应用 反转录试剂盒进行反转录,得到第 1 链 cDNA。以其为模板, 采用包国强等 3, 4在构建人源噬菌体 Fab 抗体库中优化的人 抗体轻链 5和 3端引物,两两配对,分别建立 PCR 反应体系 扩增人抗体轻链全套基因。PCR 反应条件为 95 1 min, 56 1 min, 72 1 min, 30 个循环后 72再延伸 10 min。将
14、 PCR 产物进行 12 g/ L 琼脂糖凝胶电泳后,回收纯化人抗体全 套轻链基因片段。 1. 2. 2 细菌形式杂合 Fab 抗体库的构建与鉴定 Bluescript KS/ Fd 经 Spe I + Xho I 双酶切得到鼠源 Fd 片段,克隆入 pComb3X 后得到重组的 pComb3X/ Fd 作为杂合抗体库的构建 载体。用 Sac I + Xba I 分别酶切轻链 PCR 产物和 pComb3X/ Fd 质粒,经 12 g/ L 琼脂糖凝胶电泳回收纯化后 16 过夜连 接 (PCR 产物和 pComb3X/ Fd 质粒分子摩尔比 6:1) 。连接产 物经糖元沉淀、灭菌无离子水重悬后
15、, 2. 5 KV 下电转化 50 L XL1-Blue 感受态菌并立即加入1 mL soc 培养液, 250 r/ min 恢 复性慢速振摇 1 h,涂 SOB-GAT 平板, 30过夜培养,次日将 所有克隆用 2YT-GAT 培养液轻轻刮下收集 (即细菌形式的杂 合 Fab 抗体库) 。对每批菌液,取少量稀释涂布 LB-A + T + 平 皿,通过计数克隆估算库容。随机挑取 10 个克隆,Sac I + Xba I 双酶切鉴定轻链基因的重组率。对各克隆中轻链基因 分别测序,利用 V-BASE 数据库的 DNAPLOT 分析杂合 Fab 库 中轻链基因的分布多样性。 1. 2. 3 杂合 F
16、ab 抗体库的表达展示与淘筛 将细菌形式的 杂合库 6 mL 接种培养于 200 mL 2YT-GAT 培养液,A600=0. 5 时加入 1012pfu 的 M13K07 静置挽救 30 min 后,离心去糖,重 悬于 200 mL 2YT-AKT 培养液中,30 250 r/ min 过夜培养。 次日 4 离心收集上清,用 40 mL/ L PEG8000 和 30 mL/ L NaCl 沉淀后,2 mL PBS 溶解重悬,即为表达的噬菌体杂合 Fab 抗体库。4过夜包被纯化的人 -sm (第 1、2、3 轮包被 浓度分别为 20、 10、 5 mg/ L) ,每孔加入 50 L 展示的噬
17、菌体 抗体库室温孵育 1 h。弃去未结合的库后用 PBS (含 500 L/ L 的 Tween20) 缓冲液反复洗涤,加入 50 L 甘氨酸-HCl (0. 1 mol/ L,pH 2. 2, 1 mL/ L BSA) 洗脱 10 min, 2 L 2 mol/ L Tris 中和后加入对数生长早中期的 XL1-Blue 菌 (100 L/ 孔) , 37缓慢振摇 1 h 后涂 SOB-GAT 平板,30过夜培养。次日 刮菌进行下一轮的挽救和淘筛。每轮淘筛前后计算噬菌体投 入/ 产出比 (回收率) 作为特异性噬菌体抗体富集的指标。同 时随机挑取 10 个克隆 Sac I + Xba I 酶切
18、鉴定轻链基因重组率 的变化。 1. 2. 4 特异性阳性克隆的鉴定与分析 随机挑取第 3 轮淘 筛后的 120 个克隆,分别接种入 5 mL 2YT-GAT 液中 37培 养至 A6000. 6,离心重悬于含 IPTG (终浓度 1 mmol/ L) 的 2YT-AT 液后 30、 280 r/ min 过夜培养。4 000 r/ min 离心收 集诱导菌, 加 PBS 于37和 -70反复冻融 4 次, 15 000 r/ min 离心取上清,即为 P蛋白融合抗体。以纯化的人 -sm (10 mg/ L)为包被抗原 (同时包被 GST、BSA、OVA 无关抗原 作为阴性对照,PBS 作为空白
19、对照) ,以1: 3 000 稀释的 HRP- 羊抗人 IgG (H + L) 为二抗,对融合抗体进行 ELISA 检测。以 纯化 -sm 包板 (10 mg/ L) ,然后分 3 组进行 ELISA 结合抑制 实验:第 1 组用梯度稀释的 -sm;第 2 组用梯度稀释的原核 表达的 GST;第3 组用梯度稀释的鼠源 E4B7 抗体。分别与阳 性克隆诱导表达上清等体积混合作为一抗进行检测,以诱导 表达上清与 PBS 等体积混合液作为对照计算结合率。选择 ELISA 检测阳性信号均较强的克隆,以设计的 Pcomb3X 轻链 克隆基因测序引物 (正向:5-cagctatcgcgattgcagtgg
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