低分子肝素对四环素诱导兔胸膜粘连的影响.pdf
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1、低分子肝素对四环素诱导兔胸膜粘连的影响 王玉梅, 孙耕耘 (安徽医科大学第一附属医院呼吸内科, 安徽 合肥 230022) 收稿日期: 2004 -12 -01, 修回日期: 2005 -03 -14 基金项目: 安徽省教育厅中青年学科带头人培养基金资助项目 (No 2003-3563#) 作者简介: 王玉梅 (1973 - ) , 女, 硕士生, 研究方向: 胸腔积液, Tel: 0551-2922913, E-mail: yinsdy2003 yahoo. com; 孙耕耘 (1964 - ) , 男, 主任医师, 教授, 博士生导师, 研究 方向: 胸腔积液和急性呼吸窘迫综合征, 通讯作
2、者, Tel: 0551-2922904, E-mail: sungengyun tom. net 中国图书分类号: R-332; R 322. 36; R 329. 24; R 561. 302. 2; R 973. 2 文献标识码: A 文章编号: 1001 -1978 (2005) 09 -1133 -04 摘要: 目的 建立四环素诱导兔胸膜粘连模型并探索低分子 肝素对胸膜粘连的预防作用。方法 30 只新西兰大白兔, 随机分为模型组、 治疗组和对照组, 前两组于右胸腔注入四 环素 35 mgkg -1, 对照组注入生理盐水; 治疗组于注药后 2, 24, 48, 72 h 分别于右胸腔注
3、入低分子肝素 55 Ukg -1, 模 型组则分别注入生理盐水 2. 0 ml, 至 14 d 时处死观察。结 果 四环素注射后 2 h 即出现胸膜腔积液, 2 3 d 积液量最 多, 胸水白细胞聚集和促凝活性升高, 至 14 d 时出现胸膜纤 维化及粘连, 胸膜粘连积分 3. 2 0. 4; 治疗组胸液量明显减 少, 胸水促凝活性明显降低, 至 14 d 时未形成胸膜粘连。结 论 使用四环素35 mgkg -1能够建立较满意的兔炎性胸膜 腔积液及胸膜粘连模型, 低分子肝素具有抗凝、 减少胸液渗 出、 防止胸膜粘连的作用。 关键词: 胸膜粘连; 兔; 动物模型; 低分子肝素 胸腔积液中凝血活性
4、升高和纤溶功能受抑制是 导致胸膜腔纤维蛋白形成的重要机制 1。凝血活 性升高表现为一期复钙时间缩短, 纤溶活性被抑制 的主要原因纤溶酶原激活剂抑制因子含量升高 2。 凝血/ 纤溶的失衡使纤维蛋白持续沉积于受损的脏 壁层胸膜形成纤维素膜, 后者包裹并分隔受损的胸 膜腔, 成纤维细胞在其上聚集、 增殖, 释放胶原蛋白, 形成缺乏弹性的纤维蛋白板。国内外已有许多报道 胸膜腔内给予肝素或尿激酶, 用以防治胸膜粘连。 低分子肝素 (low-molecular-weight heparin, LMWH) 与肝素相比, 其半衰期长, 生物利用度较大, 引起血 小板减少和自发性出血较少, 无须实验室监测等优
5、点。然而目前尚未见 LMWH 用于治疗胸膜腔积液 的报告。因此我们选用 LMWH 胸腔内注射进行干 预, 观察其降低胸水凝血活性、 炎性渗出, 预防纤维 化粘连的疗效。 1 材料与方法 1. 1 材料 1. 1. 1 动物 新西兰大白兔 30 只, 体重 2 3 kg, 购自安徽医科大学实验动物中心。 1. 1. 2 试剂 四环素盐酸盐为 Sigma 公司产品。 低分子肝素由杭州九源基因工程有限公司提供, 批 号: H19990036。 1.2 实验方法 3%戊巴比妥钠 1 mlkg -1耳缘静 脉注射麻醉。剃去右胸壁毛, 置兔于左侧卧位。常 规消毒, 无菌条件下在距右肋缘上 2 cm、 脊柱
6、旁 4 cm 处作 0. 5 cm 切口, 钝性分离皮下组织, 当到达壁 层胸膜后用弯钳轻轻捅破壁层胸膜, 插入静脉输液 用软硅胶管, 然后缝合, 导管远端经皮下固定在两肩 胛骨间的背部皮肤上。端口用一密封塞套住, 用 7 号针头经密封塞抽吸空气及胸腔积液。 30 只动物随机分为 3 组, 模型组、 治疗组和对 照组各 10 只, 前两组经导管注射四环素 35 mg kg -1, 四环素用生理盐水 2. 0 ml 溶解; 对照组注入 生理盐水 2. 0 ml, 时间标记为 “0” 点。治疗组于四 环素注射后 2, 24, 48, 72 h 分别注入 LMWH 55 U kg -1; 模型组经导
7、管注入 2 ml 生理盐水。 1. 3 标本采集方法 每 24 h 经胸导管收集胸腔积 液1 次, 直到 d 4 拔管为止。取0. 9 ml 胸液, 置于含 0. 1 ml (1/10 体积) 0. 109 mmolL -1枸橼酸钠抗凝 液的试管中, 4 000 rmin -1离心 10 min, 收集上清 液, -70保存, 待测促凝活性。分别于实验前、 24、 48、 72、 96 h 4 个时间点从兔耳中动脉抽血1. 8 ml 置 入 3. 8% 枸橼酸钠抗凝试管, 待测凝血酶原时间 (PT) 和活化部分凝血活酶时间 (APTT) 。 用 Vitro 950 生化自动分析仪 ( John
8、son and Johnson, Rchester, NY) 测定胸水中蛋白质含量, 同时 进行白细胞计数。血 PT、 APTT 测定采用血凝仪 (Diagnostica stago, France) 。胸水促凝活性采用一 期复钙时间分析, 复钙时间缩短表明胸水促凝活性 增强 2。 实验 d14 经静脉注射苯巴比妥处死动物。剖 胸, 通过膈肌沿锁骨中线剪开胸壁, 充分暴露胸膜 腔, 在未知分组的情况下由两位未参加实验的研究 3311中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Sep; 21 (9) : 1133 6 者评定, 记录胸膜粘连积分,
9、有无血胸及纵隔移位。 胸膜粘连积分标准: 0 分, 正常胸膜腔; 1 分, 胸 膜腔内 1 3 条粘连带; 2 分, 3 条以上粘连带; 3 分, 胸膜腔内每个区域有散在粘连带, 分离肺与胸壁较 困难; 4 分, 整个胸腔由于粘连而闭合。 所有动物在第 6 肋间割取胸膜, 10% 福尔马林 固定、 石蜡包埋、 切片, 行 HE 染色, 光镜下观察并测 量胸膜厚度。 1. 4 统计学处理 实验数据以-x s 表示, 经 t 检验 进行组间比较。 2 结果 2. 1 胸液消长 对照组胸膜腔所注 2. 0 ml 生理盐 水在 1 d 内完全吸收。模型组在四环素注入后 2 h 即开始出现胸液, 为淡黄
10、色, 48 72 h 达到最高峰, 渐转为淡血性, 此后逐渐吸收、 减少。第 24, 48, 72, 96 h 共 4 个时相点的胸液量分别为 (5. 9 2. 4) ml, (10. 7 5. 3) ml,(11. 7 2. 3) ml 和 (6. 4 2. 8) ml。 治疗组胸液出现的高峰延迟, 且容量较对照组明显 减少, 至 d 4 时, 10 只兔中有 4 只已完全吸收, 6 只 积液量平均 (1. 6 2. 4) ml, 两组相比差异有显著性 (P 500 s) 明显延 长, 表明胸液促凝活性降低 (Tab 1) 。 2. 4 统计结果 治疗组胸腔内注射 LMWH 前后血 PT、
11、APTT 相比差异无显著性 (Tab 2) 。 Tab 1 The effect of LMWH on pleural fluid characteristics and recalcification time in tetracyline-induced pleurisy Group Hours / h Pleural fluil / ml Protein / gL -1 Leukocyte / 109L -1 Recalcifi- cation time / s Treatment242.4 3.3*41.3 3.05.99 1.80500 Model245.9 2.445.0 1.26
12、.57 1.65138 19 Treatment482.7 3.6*46.7 6.94.84 1.63500 Model4810.7 5.343.6 1.34.35 0.77167 18 Treatment721.2 1.5*42.7 6.32.34 0.77500 Model7211.7 2.342.7 1.01.86 0.45203 38 Treatment961.6 2.4*42.1 5.21.97 0.70500 Model966.4 2.841.9 2.41.68 0.64245 38 *P 0. 05,*P 0. 01 vs model Tab 2 The blood PT and
13、 APTT in treatment group rabbits Pretreatment24 h48 h72 h96 h PT8. 8 1. 48. 3 0. 78. 7 0. 98. 8 1. 18. 9 1. 4 APTT16. 7 2. 1 17. 3 2. 8 15. 2 3. 1 15. 6 2. 7 15.2 2. 3 2. 5 胸膜粘连积分 模型组胸膜粘连积分是 3. 2 0. 4 (Fig 1) , 有 1 例出现血胸, 胸膜腔完全包裹。 治疗组胸膜的纤维化及粘连较对照组减轻, d 14 时 实验组无一例遗留胸膜包裹 (Fig 2) , 对照组胸膜正 常, 未见粘连及包裹。
14、Fig 1 Typical adhesion between the visceral and parietal pleural surfaces in model group Fig 2 No adhesion between the visceral and parietal pleural sur- faces in treatment group 2. 6 胸膜病理改变和胸膜厚度 光镜下: 模型组 脏、 壁层胸膜均显著纤维化, 胸膜表面反应性间皮细 胞呈立方形增生; 治疗组胸膜轻度纤维化。胸膜厚 度: 模型组 (0. 768 0. 596)mm (Fig 3) ; 治疗组 (0. 11
15、1 0. 09)mm (Fig 4) 。两组相比差异有显著 性 (P 0. 05) 。对照组胸膜正常, 未见增厚及纤维 粘连。 Fig 3 Marked fibrous pleural thickening in model group HE 200 Fig 4 Mild fibrous pleural thickening in treatment group HE 200 3 讨论 3.1 模型评价 四环素被临床广泛用于胸膜固定 术, 其作用机制主要是刺激和破坏脏、 壁层胸膜的间 皮细胞, 增加毛细血管的通透性, 使凝血因子积聚于 胸膜腔, 并使纤维蛋白溶解活性灭活, 纤维蛋白附着 431
16、1中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Sep; 21 (9) 于胸膜腔表面, 使胸膜纤维化粘连、 包裹形成 3。 Itells 等 4发现在四环素诱导的兔胸膜炎症模型中, 纤维蛋白逆转途径类似于人渗出性胸膜炎的特征。 在兔和人胸水中促凝活性均易检出, 主要是组织因 子、 FXa、 FIIa 活性升高, 表现为一期复钙时间缩短, 胸水较易出现凝块。 本研究显示, 四环素注入兔胸膜腔可以产生较 为明显的胸膜腔炎性积液, 在胸膜炎的发展过程中, 渗出液的消长及渗出液中的白细胞含量发生规律性 变化, 类似于人炎性胸膜腔积液。继而出现胸腔积 液包裹
17、、 胸膜纤维化粘连, 形成较为理想的炎性胸腔 积液后胸膜粘连模型。 在预实验中发现: 四环素 20 mgkg -1组积液 量产生不足, 纤维化包裹粘连不明显, 粘连积分在 1 2 分之间; 35 mgkg -1组可产生明显的胸膜腔积 液及显著胸膜粘连包裹, 积分平均为 (3. 2 0. 4) 分。 3. 2 LMWH 疗效评价 肝素仍然是常用、 有效的 抗凝剂, 但其缺点是剂量个体差异大。除小剂量肝 素疗法外, 给药期间常需进行实验室监测; 效益/ 风 险比值小, 出血副作用多; 不能抑制与纤维蛋白结合 的凝血酶 (Fa) , 停药后易复发。LMWH 是普通肝 素通过化学或酶学方法使其解聚而获
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