体外构建可注射性组织工程软骨的初步研究.pdf
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1、书书书 文章编号: 1000-5404 (2006) 11-1145-03 论著 体外构建可注射性组织工程软骨的初步研究 王东武, 杨 柳, 段小军, 李 忠 (第三军医大学西南医院关节外科中心, 重庆 400038) 提 要:目的 利用关节软骨细胞复合壳聚糖-磷酸甘油 (chitosan/ glycerophosphate,C/ GP) 凝胶, 体外构建可注射性 组织工程软骨, 为微创方式治疗关节软骨缺损提供依据。方法 以体外培养扩增的兔关节软骨细胞为种子细胞, 以自制 温固化可注射 C/ GP 凝胶为支架, 按 5 107/ ml 细胞浓度复合体外培养。于倒置显微镜下观察细胞形态与分布,
2、四甲基偶 氮唑盐 (MTT) 法计算培养 1 周时种子细胞存活率, 培养 4 周时样本进行组织学及扫描电镜观察。结果 软骨细胞在 7: 1 (体积分数) C/ GP 凝胶中保持球形, 细胞存活率 95%以上; HE 染色可见软骨较为典型的陷窝样结构、 软骨囊及同源细胞 群等现象; 甲苯胺蓝异染及免疫组化型胶原染色呈强阳性。结论 软骨细胞在 C/ GP 凝胶中可存活并保持分泌软骨基 质的功能, 形成类软骨组织。温固化可注射性 C/ GP 凝胶能作为软骨组织工程的载体材料。 关键词:关节;软骨细胞;壳聚糖;甘油磷酸钠;支架/ 组织工程 中图法分类号:R-33;R318. 08;R318. 17 文
3、献标识码:A Construction of injectable tissue engineered cartilage in vitro WANG Dong-wu,YANG Liu,DUAN Xiao-jun,LI Zhong(Joint Surgery Center,Southwest Hospital,Third Military Medical Uni- versity,Chongqing 400038,China) Abstract:Objective To observe the biological behavior of chondrocytes in chitosan ba
4、sed hydrogel in vitro and to evaluate the possibility of chitosan and glycerophosphate mixed gel using as injectable scaffolds in tissue engineering. Methods A novel injectable thermosetting gel was made of chitosan and glycerophosphate mixture. Chondrocytes isolated by enzymic digestion from the ar
5、ticular cartilage of the young rabbits aged 3 -4 weeks were cultured in monolayer system. After primary culture and subculturing,the cells were seeded in chi- tosan based gel in concentration of 5 107/ ml in vitro. Characteristics of chondrocytes during 4-week culture were observed with invert micro
6、scope. MTT was used to detect the seed growth after one-week culture. In 4th week,after haematoxylin eosine and toluidine blue staining,the artifical cartilage was performed type colla- gen immunohistochemistry and observed by scanning electron microscope. ResuIts Chondrocytes retained their round m
7、orphology,multiplied,and produced matrix in chitosan and glycerophosphate mixture gels. The results of immunohistochemistry were strongly positive. ConcIusion That most chondrocytes appeared to occu- py large areas of rough chitosan based gels,guarantees a suitable environment where chondrocytes sec
8、rete ma- trix macromolecules and preserve their round morphology in vitro. Chitosan and glycerophosphate mixture gel may be a vehicle for injectable tissue - engineered cartilage. Key words:articular;chondrocyte;chitosan;glycerophosphate;scaffold/ tissue engineering 基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (30270375) ; 全
9、军医学科学技术研究 “十五” 计划重点课题 (01Z072) ; 重庆市重点科技攻关项目 (2003 -13 -6) Supported by the National Natural Science Foundation of China (30270375) , the Scientific Research Foundation for Medical Science and Public Health of PLA(01Z072)and the Foundation for the Key Sci & Tech Research Project of Chongqing(2003 -1
10、3 -6) 作者简介: 王东武 (1974 - ) , 男, 山西省孝义市人, 硕士研究生, 医师, 主要从 事软骨组织工程及关节软骨缺损修复方面的研究。电话:(023) 68773007 通讯作者: 杨 柳, 电话:(023) 68765280, E-mail: jointsurgerymail. tmmu. com. cn 收稿日期: 2005-09-29; 修回日期: 2006-03-19 临床用于治疗关节软骨缺损的方法虽然很多但都 存在不足。应用组织工程技术治疗关节软骨缺损是目 前被看好的方法之一。其基本思路是将一定数量的关 节软骨细胞 (或前体细胞、 干细胞) 接种到适宜的支架 中,
11、 培养形成具有生物功能和组织结构的透明软骨, 再 移植到人体关节缺损部位, 达到重建关节面的目的。 另外, 由于外科领域中各类腔镜的广泛应用, 微创观念 已成为大家的共识。应用可注射性组织工程软骨修复 关节软骨缺损, 则可取两者优长, 具有很好的应用前 景。本研究观察细胞在壳聚糖-磷酸甘油 (chitosan/ 5411 第 28 卷第 11 期 2006 年 6 月 第 三 军 医 大 学 学 报 ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE Vol. 28,No. 11 Jun. 2006 glycerophosphate,C/ GP) 凝胶中的存活
12、、 生长和分泌软 骨基质的功能, 有望为微创方式修复关节软骨缺损摸 索一种新的可注射性组织工程软骨。 1 材料与方法 1. 1 材料 壳聚糖 (玉环,浙江) ; 甘油磷酸钠 (Fluka,瑞士) ; 免疫组 化染色试剂盒 SABC (博士德, 武汉) ; 小鼠抗兔型胶原单抗 (Calbiochem, 美国) ; 胰蛋白酶 (Gibco,美国) ; 型胶原酶 10 ml (Sigma,美国) 1. 2 方法 1. 2. 1 软骨细胞的获取与扩增 3 4 周龄家兔, 体质量 300 400 g (第三军医大学实验动物中心提供) , 无菌操作取四 肢关节软骨, 切成1. 0 mm3颗粒, 0. 2%
13、胶原酶消化, 离心收集细 胞。以 5 104/ cm2接种于培养瓶中, 加完全培养液 (DMEM + 10%胎牛血清) , 置 37 孵箱培育, 隔日换液。细胞长满瓶底 85%时, 0. 25% 胰酶消化收集细胞, 以 6 103/ cm2传代扩增细 胞, 备用。 1. 2. 2 可注射性 C/ GP 温固化凝胶的制备 1 实验用壳聚 糖规格为: 脱乙酰度 95. 11%, 粘度 155 mpas, 分子量 870 103, 医用级。5 g 壳聚糖溶解于 250 ml 0. 1 mol/ L 的稀盐酸, 混 匀, 121 消毒20 min; 28 g 磷酸甘油, 以50 ml 去离子水溶解,
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