体外诱导万古霉素耐药金葡菌及耐药菌株抗生素敏感性变化分析.pdf
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1、文章编号: 1 0 0 2 - 2 6 9 4 (2 0 0 5) 0 7 - 0 5 9 8 - 0 4 体外诱导万古霉素耐药金葡菌及耐药菌株 抗生素敏感性变化分析 代洪, 范学工 摘要: 目的诱导对万古霉素耐药金葡菌, 分析金葡菌对万古霉素耐药后其他的药物敏感性变化情况。方法在体外 用万古霉素对1 5株金葡菌进行诱导; 诱导过程中检测2 3 S r R N A基因对菌种进行鉴定; 诱导出万古霉素耐药金葡菌后, 检测 耐药菌株其他抗生素药物敏感性并与诱导前进行比较。结果诱导出3株对万古霉素中介耐药金葡菌; 诱导前后菌株都扩增 出金葡菌2 3 S r R N A基因; 对万古霉素耐药后金葡菌对
2、其他抗生素药物敏感性也发生改变。结论万古霉素体外很难诱导完 全耐药菌株, 但可以诱导出中介耐药菌株; 对万古霉素耐药后金葡菌对其他抗生素耐药性也增加。 关键词: 金黄色葡萄球菌; 万古霉素 ; 耐药 中图分类号: R 3 7 8 . 2 文献标识码: A I nv i t r o i n d u c t i o no f r e s i s t a n c e i nS t a p h y l o c o c c u s a u r e u s t ov a n c o L y c i na n d t h e s u s c e p t i b i l i t yo f o t h e r
3、a n t i b i o t i c s a g a i n s t t h e v a n c o L y c i n - r e s i s t a n tS.a u r e u s D A IH o n g,F A NX u e - g o n g (D e p a r t m e n t o f I n f e c t i o u sD i s e a s e, X i a n g y aH o s p i t a l,C e n t r a l S o u t hU n i v e r s i t y,C h a n g s h a4 1 0 0 0 8,C h i n a) A
4、B S T R A C T:T o i n d u c e t h ev a n c o m y c i n - r e s i s t a n t s t r a i n s o fS t a p h y l o c o c c u s s u r e u sa n d t oa n a l y z e t h e c h a n g e i ns u s c e p t i b i l i t yo f t h i s s t r a i no f o r g a n i s m s t oo t h e ra n t i b i o t i c s,1 5s t r a i n so f
5、S.a u r e u sw e r e i n d u c e di nv i t r ob ym e a n so fv a n c o m y c i n,a n dt h e2 3 S r R N Ag e n ew a s i d e n t i f i e d i n t h e c o u r s e o f i n d u c t i o n .W h e n t h ev a n c o m y c i n - r e s i s t a n t s t r a i nh a db e e n i n d u c e d,t h e s u s c e p t i b i l
6、 i t i e s o f t h e r e s i s t a n t s t r a i n t o o t h e r a n t i b i o t i c sw e r e d e t e r m i n e da n d c o m p a r e dw i t h t h o s e b e f o r e i n d u c t i o n . T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t 3 s t r a i n s o f t h e v a n c o m y c i n - r e s i s t a n tS.a u r e u
7、 sw e r e o b t a i n e d,a n d t h e 2 3 S r R N Ag e n e o fS.a u r e u sw a s a m p l i f i e d b e f o r e a n d a f t e r i n d u c t i o n . D e f i n i t e c h a n g e s i n t h e s u s c e p t i b i l i t y t o o t h e r a n t i b i o t i c s c o u l db e d e m o n s t r a t e d i n t h em e
8、 a n t i m e a n d t h eM I Cv a l u e s o f o t h e r a n t i b i - o t i c s a g a i n s tS.a u r e u si n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y a f t e r t h e r e s i s t a n c e t ov a n c o m y c i nh a db e e n i n d u c e d . I t c o n c l u d e s t h a ti nv i t r oi n d u c - t i o no f
9、c o m p l e t e r e s i s t a n c e o fS.a u r e u st ov a n c o m y c i n i s r a t h e r d i f f i c u l t,b u t a f t e r b e i n g r e s i s t a n t,t h e s u s c e p t i b i l i t yo f o t h e r a n t i b i - o t i c s a g a i n s tS.a u r e u sm a yb e c h a n g e d . K E YWO R D S:S t a p h y
10、 l o c o c c u s a u r e u s;v a n c o m y c i n;d r u g r e s i s t i b i l i t y 金黄色葡萄球菌 (金葡菌)(S t a p h y l o c o c c u sa u - r e u s) 是医院感染的主要病原菌之一。万古霉素是 糖肽类抗生素, 是目前临床上为数不多的仍对多重 耐药性金葡菌具有活性的药物之一, 是治疗耐甲氧 西林金葡菌 (m e t h i c i l l i nr e s i s t a n tS . a u r e u s,MR S A) 感染的首选药物。从对万古霉素敏感性稍降低, 到
11、中介耐药, 再到完全耐药, 金葡菌对万古霉素耐药情 况越来越严重 1 - 3 。为防止和减缓耐药株的蔓延, 更好地治疗金葡菌引起的感染性疾病, 研究该菌对 万古霉素的耐药机制显得尤为迫切。在我国, 迄今 无万古霉素耐药金葡菌的报道。为研究金葡菌对万 古霉素耐药机制, 我们在体外诱导万古霉素耐药金 葡菌, 并对诱导后耐药菌株进行其他抗生素的敏感 性实验, 并与诱导前菌株比较, 以了解诱导后耐药金 葡菌对其他抗生素敏感性。 1 材料与方法 1 . 1 菌株 1 5株金葡菌均为2 0 0 2年1 0月2 0 0 3 年1月中南大学湘雅医院和湘雅二医院检验科细菌 室分离, 以常规方法鉴定, 并经法国生
12、物梅里埃A P I 系统上机鉴定。其中1 0株为MR S A, 5株为甲氧西 林敏感金黄色葡萄球菌 (m e t h i c i l l i ns u s c e p t i b l eS . a u r e u s,M S S A) 。1 5株金葡菌对万古霉素M I C皆 作者单位: 中南大学湘雅医院传染科, 长沙 4 1 0 0 0 6 895 中 国 人 兽 共 患 病 杂 志 C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e s 2 0 0 5,2 1(7) 2g m l, 已排除非万古霉素异质性耐药菌株 4 。 质控菌株金葡菌A T C C
13、2 5 9 2 3和表皮葡萄球菌 A T C C 2 6 0 6 9购自中国药品生物鉴定所。 1 . 2 试剂万古霉素、 溶葡萄球菌素为美国S i g m a 公司产品; 脑心浸液购自中国药品生物鉴定所; M u e l l e r - H i n t o n (M - H) 肉汤和M-H琼脂购自上海 腹泻疾病中心;E - t e s t药敏纸片为A BB I O D I S K公 司产品。引物由大连宝生物工程有限公司合成; T a qD N A聚合酶购自上海生工生物公司;d N T P、 R N A酶购自北京鼎国生物公司。 1 . 3 对万古霉素M I C测定采用琼脂稀释法。若 琼脂稀释法测
14、得M I C 8 g m l, 则用E - t e s t法再确 证。金葡菌对万古霉素M I C4 g m l为敏感, 3 2g m l为耐药, 在8 - 1 6 g m l之间为中介耐药。 1 . 4 耐药菌株诱导按照文献 5 - 6的方法进行诱 导: 过夜血琼脂培养的细菌用生理盐水调制成 1 0 8 C F Um l, 取1 0 0L均匀涂布于2g m l万古霉 素脑心浸液琼脂平板上, 3 7 恒温培养4 8 h, 如有菌 落生长, 则转种4 g m l万古霉素脑心浸液琼脂平 板上培养, 4g m l万古霉素脑心浸液琼脂平板上有 菌落生长, 将菌株转种8 g m L万古霉素脑心浸液 琼脂平
15、板培养, 此后就在8 g m l万古霉素脑心浸 液琼脂平板上培养, 连续传代6 0代。每间隔5代鉴 定菌种及检测菌株对万古霉素的M I C。 1 . 5 诱导产生的耐药菌株耐药稳定性试验将诱 导产生的耐药菌株用无抗生素的B H I A培养基培 养, 每天测定M I C, 计数M I C持续不变的天数。 1 . 6 金葡菌2 3 Sr R N A基因检测为排除污染菌 的可能, 对金葡菌进行2 3 Sr R N A基因检测。参照 文献制备 7金葡菌基因组 D N A。参照文献 8 - 9合 成引物, 上游引物: 5A C GG A GT T AC A AA G G A C GA C3 ; 下游引物
16、:5A G CT C A G C CT T A A C GA G TA C3 。P C R扩增金葡菌2 3 Sr R N A基 因: 反应总体积3 0 l, 加入灭菌双蒸水2 2 . 1l,1 0 * P C R B u f f e r 3 .0l,2 5 m m o l L M g C L 2 1 .8 l, 5 0m o l L引物各0 . 2l,1 0 m m o l Ld N T P s 0 . 6 l, 3 0 n g LD N A模板2 l,5 ULT a qD N A聚合酶0 . 1l。置D N A扩增仪上扩增, 条件为:9 4 预变性 5 m i n;9 4 变性4 0 s,6
17、 4 退火1 m i n,7 2 延伸7 5 s, 共3 7个循环; 最后7 2 延伸1 0 m i n。取扩增产物 8 . 0l在1 . 5 %琼脂糖凝胶 (含0 . 5g m l溴乙锭) 中 电泳, 电压为5 V c m, 紫外透射仪上观察, 凝胶一次 性成像系统照像。 1 .7 药物敏感试验利用美国D A D E M i c r o S c a n W a l k a w a y9 6全自动细菌分析仪快速栽种系统, 分 别挑取对万古霉素敏感及中介耐药金葡菌菌落, 接 种至反应板, 过夜观测, 打印1 0种抗生素药物敏感 性试验报告。 2 结果 2 . 1 耐药菌株诱导有3株金葡菌经过4
18、5 6 0代诱 导, 对万古霉素产生中介耐药。其它菌株对万古霉素 仍然敏感 (对万古霉素M I C皆 4 g m L) , 见表1。 表1诱导过程中3株金葡菌对万古霉素M I C改变情况 T A B L E1 . T h e c h a n g e s o f 3s t a i n sM I Co f v a n c o L y c i n 菌株 对万古霉素M I C( g m L) 诱导前 5 *1 01 52 02 53 03 54 04 55 05 56 0 A 1 80 . 50 . 50 . 50 . 51 . 02 . 04 . 04 . 04 . 08 . 01 2 . 01 2
19、 . 01 2 . 0 A 5 62 . 02 . 02 . 02 . 02 . 02 . 02 . 02 . 04 . 08 . 01 2 . 01 2 . 01 2 . 0 A 5 90 . 2 50 . 2 50 . 2 51 . 01 . 01 . 01 . 02 . 04 . 04 . 08 . 01 6 . 01 6 . 0 注:*指诱导代数 2 . 2 耐药菌株稳定性试验将3株中介耐药金葡菌 (诱导第6 0代) 用无抗生素的脑心浸液琼脂培养基 培养, 每天测定M I C,在无万古霉素的脑心浸液琼 脂培养基上分别连续培养1 6 2 2 d后, M I C皆变为 4g m L(图1)
20、 。 2 . 3 金葡菌2 3 Sr R N A基因检测金葡菌连续传 代, 表型 (如凝固酶活性) 有改变, 为了排除污染菌, 对6株凝固酶活性降低金葡菌 (包括3株万古霉素 中介耐药金葡菌) 进行2 3 s r R N A基因检测。6株凝 固酶活性降低金葡菌诱导前及诱导后都扩增出金葡 菌2 3 Sr R N A基因 (1 3 5 0 b p)(图2、 图3) 。 图1 A 1 8、 A 5 6和A 5 9耐药菌株稳定性试验 F i g . 1 T h e s t a b i l i t yo f 3s t r a i n s r e s i s t a n c e t o v a n c o
21、 L y c i n 995 2 0 0 5,2 1(7) 中 国 人 兽 共 患 病 杂 志 C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e s 图2金葡菌诱导前2 3 S r R N A基因扩增产物电泳图谱 M a r k: 相 对 分 子 质 量 参 照 标 准;18分 别 是: 金 葡 菌 A T C C 2 5 9 2 3,表葡菌A T C C 2 6 0 6 9,A 1 8,A 5 6,A 5 9,A 1 1 0, A 1 1 3,A 1 3 2 F i g . 2A g a r o s eg e le l e c t r o p h o
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