做好细菌耐药基因检测努力满足临床需要.pdf
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1、作者单位: 100730 中国医学科学院 北京协和医院检验科 述评 做好细菌耐药基因检测 努力满足临床需要 王辉 陈民钧 【摘要】 抗菌药物耐药性的检测包括常规药敏试验和耐药基因的检测。耐药基因的检测多以 聚合酶链反应为基础, 可以直接检测标本, 从而快速、 早期为临床选择抗菌药物提供依据。我国在耐 药基因检测的基础研究方面取得了很大成绩, 但还缺乏分子检测耐药基因的应用研究。 【关键词】 基因组, 细菌; 抗药性, 微生物; 临床医学 To improve the detection of antimicrobial resistance genes in bacteria and sati
2、sfy the need of the clinics WANG Hui, CHEN Min-jun. Department of Clinical Laboratory, PUMC hospital, CAMS and PUMC, Beijing, 100730, China 【Abstract】 Antimicrobials resistance can be detected by conventional susceptibility testing and genetic method. Most genetic methods are based on PCR,and can be
3、 used directly in clinical specimens to guide therapy early and rapidly. Great achievement has made in basic study of antimicrobial resistance genes in China. Applied studies in genetic method of resistance genes are needed. 【Key words】 Genome, bacteria; Drug resistance microbial; Clinical medicine
4、随着抗菌药物的广泛使用, 细菌的耐药性不断增加。因此, 及时准确地检测耐药性有利于临床合理使用 抗菌药物。耐药性的检测可以分为常规表型检测 (即药敏试验) 和耐药基因型检测。常规药敏试验首先需 要通过培养的方法从临床标本中分离到菌株, 而许多生长较慢和不易培养的细菌, 是无法通过常规药敏试验 检测其耐药性的。在过去的 20 年, 为适应临床需要, 以 DNA 探针和聚合酶链反应 (PCR) 为基础的分子 手段检测耐药基因取得了很大进展, 其中部分方法已被美国食品和药品管理局 (FDA) 批准用于临床工作 1。 为什么我们需要分子方法检测耐药基因?其优势是什么? 首先, 分子方法可以直接从临床标
5、本入手, 而无须菌株的培养。因此, 这极大地节省了时间, 特别是对于 那些已经使用过大量抗菌药物造成培养阴性和体外培养时间长或难培养的菌 (如肺炎链球菌、 结核分枝杆 菌等) , 可以较早地指导临床选择抗菌药物。在某些危及生命的感染, 如脑膜炎、 心内膜炎、 感染性休克、 骨 髓炎, 早期、 快速检测特定的耐药基因, 对临床意义重大。例如采用 PCR 方法直接检测脑脊液中肺炎链球菌 pbp2b 基因的突变, 可提示该菌是否对 内酰胺类耐药。结核分枝杆菌生长缓慢, 培养需要数周, 随着培养 时间的延长, 培养基内药物的活性下降会影响药敏试验的准确性。而采用 PCR 和 DNA 序列分析检测利福
6、平的耐药基因对金黄色葡萄球菌 (rpoB) 、 异烟肼的耐药基因 (katG) 重要位点有无突变, 可以预测这些药物 的耐药性。 其次, 分子方法可以帮助我们鉴别那些处于中介水平或常规药敏结果模棱两可的结果。例如当苯唑西 林对金黄色葡萄球菌的 MIC 在 2 8 g/ ml 时, 其机制可能是由于携带 mecA 基因, 也可能因为产生高水平 的 内酰胺酶而水解苯唑西林。对于前者, 需要使用万古霉素; 而后者, 采用酶抑制剂类或头孢菌素即可。 其三, 由于耐药基因的检测不需要培养物, 因此减轻了实验室的生物危险性。其四, 在评价一种新的药敏试 验时, 分子生物学方法是 “金标准” 。例如美国在确
7、定 4 例对万古霉素耐药的金葡菌时, 当自动化仪器和微 量肉汤法检测结果不一致时, PCR 方法检测 vanA 基因成为 “金标准” 。其五, 耐药基因的检测可以作为一种 流行病学调查的手段, 调查本医院、 本地区流行的基因型。 当然, 它与常规方法相比, 分子检测方法也有缺点。第一, 当样品中菌量很少时, 其敏感性会大大降低, 因此需要发展更好的方法浓集样品中的核酸量。第二, 对每一个测试的抗菌药物, 均需要设计相应的分子检 测方法, 一次只能检测一种耐药机制。而以培养为基础的常规方法, 可以同时测定多种不同类抗菌药物的敏 79中华检验医学杂志 2006 年 2 月第 29 卷第 2 期 C
8、hin J Lab Med, February 2006,Vol 29,No. 2 感性。第三, 目前, 仍有许多耐药机制是未知的, 因此无法进行分子检测。第四, 同其他分子试验一样, 耐药 基因的检测也会存在假阳性问题。第五, 对许多耐药基因的检测方法, 目前还缺乏多中心的、 临床对照研究 以评价其准确性、 重复性及临床应用价值。 分子方法检测耐药基因的基础是 PCR。理想的靶序列应当是耐药基因的编码区域, 而非编码区外的基 因 (如插入序列或启动子序列) 。在 PCR 基础上, 发展出来的方法还包括 PCR-单链构象多态性 (SSCP) 、 PCR-限制酶切片段多态性 (RFLP) 、 多
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