体外诱导脐血间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的初步研究.pdf
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1、细胞生物学杂志C h i n e s eJ o u r n a lo fC e l lB i o l o g y2 0 0 8 ,3 0 :3 8 3 3 8 6 h t t p :w w w c j c b o r g 体外诱导脐血间充质干细胞向胰岛 1 3 样细胞分化的初步研究 迟作华陆琰1张 洹1 唯 ( 广东药学院临床医学院附属第一医院血液内科,广州5 1 0 3 1 0 ;- 暨南大学医学院血液病研究所,广州5 1 0 6 3 2 ) 摘要探讨脐血间充质干细胞能否在体外向胰岛B 样细胞分化,并探索其诱导条件。在无菌 条件下采集正常产妇脐血,用羟乙基淀粉沉淀法分离脐血中的有核细胞,进而
2、采用贴壁筛选法获得 脐血间充质干细胞。纯化后的脐血间充质干细胞用表皮生长因子、D 巯基乙醇、高糖、激活素A 和肝细胞生长因子进行诱导。观察诱导后的细胞形态变化,采用胰岛素免疫荧光染色对诱导后的 细胞进行鉴定,定量检测胰岛素分泌水平及其对葡萄糖刺激的反应性。结果发现,经过诱导后,细 胞形态发生明显变化,形态变圆而且聚集成团;诱导后细胞的胰岛素免疫荧光染色为阳性;而且细 胞能分泌少量胰岛素,并对糖刺激具有反应性。由此提示。在体外,脐血间充质干细胞具有向胰岛 p 样细胞分化的潜能。 关键词脐血;间充质干细胞;分化;胰岛;糖尿病 成体干细胞的分化潜能是目前干细胞研究领域 的热点之一。利用成体1 二细胞
3、的可塑性,将其定向诱 导为胰岛样细胞,可以为细胞移植治疗糖尿病提供新 的种子细胞来源。最近的研究表明,小鼠骨髓贴壁细 胞,大鼠骨髓间充质干细胞以及人骨髓间充质干细胞 在体外都具有向胰岛素分泌细胞分化的潜能f l 3 1 。新 近的研究证实,脐血中除了富含造血干细胞,也含有 多潜能干细胞间充质干细胞。脐血中的间充质 干细胞与骨髓间充质T 细胞不仅在形态和细胞表面 标志方面十分相似,而且都具有非常相似的分化潜能, 可以向内、中、外三个胚层的组织细胞分化m 们。 与其他成体T 细胞相比,脐血间充质T 细胞来源丰富, 易于采集保存,采集过程对产妇及新生儿均不造成伤 害,不涉及伦理问题,免疫源性相对较低
4、,外源性污 染少,因而更具有研究价值。目前,干细胞D 样细胞 分化的研究报道较多,但未见脐血间充质T 细胞向 胰岛D 样细胞分化的研究报道。因此,本实验旨在 探讨脐血问充质干细胞能否在体外向胰岛D 样细胞 分化,为进一步的动物实验和临床研究提供依据。 1 材料与方法 1 1 分离培养扩增脐血间充质干细胞 无菌条件下采集4 0 1 0 0m l 孕3 2 4 l 周顺产或 剖宫产的胎儿脐血,2 0U m l 肝素抗凝,孕妇无传染 性疾病,胎儿无畸形,并征得家属及孕妇同意。培 养及鉴定方法参照文献【7 】。 1 2 体外向胰岛D 样细胞诱导 细胞培养至3 代,细胞达7 0 一8 0 汇合后开始 诱
5、导。移出旧培养基,用含有1 0n g m lE G F 、l m m o l LB 巯基乙醇的D M E M F 1 2 ( 不含F B S ) 诱导7 天;7 天后移出旧培养基,用P B S 洗涤两次,H D M E M 培养基添加3n g m l 活化素A ( a c t i v i nA ) ( P e p r oT e c h 公司) 和1 0n g m lH G F ( P e p r oT e c h 公司) 继续诱导, 倒置相差显微镜下观察细胞诱导后的形态变化。 1 3 诱导细胞的胰岛素免疫荧光染色 收获诱导培养的细胞( 0 2 5 胰蛋白酶溶液消化 细胞) ,P B S 洗涤1
6、 次。将细胞悬液滴于预处理过的 玻片上,均匀涂片,快速风干,- 2 0 预冷甲醇固定1 5 m i n ,P B S 洗涤1 次。0 1 T r i t o nX 一1 0 0 、3 H ,O , 温育1 0m i n ,阻断内源性过氧化物酶。l IJ 羊非免疫 血清室温封闭2 0m i n ,倾去血清,加一抗( 兔抗胰岛素 多克隆抗体1 :1 5 0 稀释,S a n t aC r u z 公司) ,4 过 夜,P B S 洗涤。加山羊抗兔一C y 3 荧光抗体( 1 :5 0 , S i g m a ) 室温作用3 0m i n ,P B S 洗涤3 次,每次5m i n 。 1 0I t
7、 g n aH o e c h s t 3 3 2 5 8 均匀覆盖细胞面,室温作用l 肌1 5 m i n ,蒸馏水冲洗3 次,每次5m i n 。缓冲甘油封片,在 收稿f 1 期:2 0 0 7 1 0 1 5接受H 期:2 0 0 8 0 1 1 4 国家自然科学蕈金 N o 0 6 7 0 9 0 2 ) 、广尔省自然科学基金( N o 0 6 3 0 0 5 4 6 ) 、广东药学院博上科研启动基金( N o 2 0 0 6 L C Y 0 3 ) 资助项目 。通讯作者。T e l :0 2 0 - 8 5 2 2 6 7 8 7 ,E m a i l :t z y u a n j
8、n u e d u c n 3 8 4 研究论文 荧光显微镜下以3 5 1n m , 5 6 8a m 分别激发H o e c h s t 3 3 2 5 8 和C y 3 ,并拍照,以仪器内部软件将二者进行合图。阴 性对照组用P B S 代替一抗,其他操作相同。 1 4 化学发光免疫分析法检测胰岛素分泌水平 取未诱导脐血间充质T 细胞的培养上清液及诱 导至3 5 4 0 天形成胰岛样细胞团的培养上清,一2 0 保存待测。用化学发光免疫分析法( 试剂盒及仪器 均来自A b b o t tA x s y mS y s t e m ) 检测各培养上清液中 胰岛素含量,按说明书进行操作。 1 5 胰
9、岛素释放 诱导至3 5 - 4 0 天的胰岛样细胞团,去除旧培养基, 用P B S 洗涤2 次,加入无血清L - D 伍M ( 含5 5 m m o F L 葡萄糖) ,温育2h 后取上清液;移出L - D M E M ,P B S 洗 涤1 次,加入无血清H D M E M ( 含2 5m m o l L 葡萄糖) , 温育2h 取上清液,2 0 保存待测。用化学发光免 疫分析法( 试剂盒及仪器均来自A b b o t tA x s y mS y s t e m ) 检测各上清中胰岛素含量,按说明书进行操作。 2 结果 2 1 脐血间充质干细胞诱导前后的形态变化 原代细胞多数早梭形,平行排列
10、,局部形成漩涡 状排列,混有圆形细胞,原代培养时间在3 0 一5 0 天左 右;传代后生长速度加快,5 8 天传代一次;传至第3 代细胞形态比较均一,呈长梭形,折光性好( 图1 A ) 。 图l 脐血间充质干细胞诱导前后的形态变化( 1 0 0 x ) A :第3 代的脐血H J 充质干细胞形态均一,呈长梭形,、r 行排列或漩涡状排列:B :绐E G F 、B 毓基乙醇诱导后,大部分细胞立体感增强,由 长梭形变为短梭形:c :改用无血清并添加活化素A 和H G F ,诱导虿1 0 人左右,细胞表现为胞体缩小胞质向核周收缩,由原来的梭形变为 圆形:D :继续诱导至1 4 1 6 天,细胞开始出现
11、聚集;E :细胞继续聚集,形成胰岛样细胞团。 图2 细胞诱导前后的胰岛素免疫荧光染色( 2 0 0 x ) A :未诱导的细胞仅见细胞核呈蓝色荧光,末见胞浆有红色C y 3 阳性荧光信号;B :诱导后的细胞可见部分细胞胞浆呈红色C y 3 荧光信号。为 胰岛素阳性表达。 迟作华等:体外诱导脐血间充质千细胞向胰岛B 样细胞分化的初步研究 3 8 5 表I化学发光免疫分析法检测胰岛素分泌水平及胰岛素释放 经第一阶段诱导一小部分细胞漂浮死亡,大部分 细胞立体感增强,折光性增强,由长梭形变为短梭形 ( 图1 B ) ;第二阶段改用无血清并添加活化素A 和 H G F ,诱导至l O 天左右,细胞表现为
12、胞体缩小,胞质 向核周收缩,由原来的梭形变为圆形,折光性增强( 图 1 C ) ;继续诱导至1 4 。1 6 天,细胞开始出现聚集( 图 l D ) ;2 0 天左右出现胰岛样细胞团( i s l e t 1 i k ec l u s t e r s , I L C s ) ,数量在4 0 个左右( 图l E ) ;3 5 4 0 天左右细胞 团的数量町增加至7 0 一1 0 0 个左右。 2 2 胰岛素免疫荧光结果 诱导后的细胞进行胰岛素免疫荧光染色,可见其 细胞浆中胰岛素染色阳性,胞浆中有很强的C y 3 红色 荧光信号( 图2 B ) ;未诱导组仪见细胞核被H o e c h s t 3
13、 3 2 5 8 染成的淡蓝色荧光信号。胞浆无红色C y 3 荧光信号 ( 图2 A ) 。 2 3 化学发光免疫分析法检测胰岛素分泌水平及 胰岛素释放 脐血间充质下细胞的培养上清液中检测不到胰 岛素,经过诱导分化后的胰岛样细胞团可检测到一定 量的胰岛素,分泌胰岛素浓度为( 0 4 3 0 1 5 ) I _ t U m l ( 表 1 ) 。诱导后的细胞分别经2 5m m o l L 和5 5m m m o l L 葡萄糖刺激2h 后,刺激指数为2 1 ,说明对葡萄糖的 刺激均有反应( 表1 ) 。 3 讨论 由以上实验结果可知,经过诱导后,细胞发生明 显的形态变化,逐渐变圆并聚集成团,形成
14、胰岛样细 胞团。诱导后的细胞经胰岛素免疫荧光染色检测, 呈阳性反应。而且,诱导后的细胞能分泌少量胰岛 素,并对糖刺激具有一定的反应性。 目前,对干细胞定向诱导分化为胰岛素分泌细胞 一般可选择三种诱导策略:( 1 ) 基因工程改造细胞;( 2 ) 改变细胞生存的微环境;( 3 ) 转基因方法和体外诱导结 合。在本实验中,我们采用了第2 种策略,通过添加 一些对细胞生长或者分化有作用的细胞因子。营养物 质,或者化学物质等进行诱导。 E G F 作为一种生长因子对多种表皮细胞和上皮 细胞的生长有刺激作用,参与损伤的修复,E G F 信号 途径通过c e r b B 受体发挥作用。B 一巯基乙醇是常用
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