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1、窑 实验研究 窑 收稿日期院2009-03-02 基金项目院福建省科技创新平台项目渊2008L0002冤袁计划生育生殖生物学国家重点实验室资助项目 作者简介院王训立渊1964要冤袁男袁副研究员袁主要从事实验动物学尧生殖生物学研究遥 催乳素渊prolactin袁PRL冤在促进哺乳动物个体 的乳腺发育尧乳汁生成和发动尧维持泌乳以及调节 黄体的功能等方面发挥重要作用咱1暂遥 由于近年来 发现在雄性动物的血清中有 PRL 存在袁 且含量并 不低袁并有一定的分泌类型袁因此袁人们推测催乳 素在雄性动物中的作用可能不是在雌性中那样是 促进泌乳袁而是对生殖方面的作用遥 研究表明袁催 乳素水平的高低与雄性动物的
2、睾酮水平季节性变 化有一定关系遥 我们的研究也发现雄性恒河猴的 睾酮分泌水平存着季节性的变化咱2暂遥 但对于催乳 素如何调节雄性恒河猴睾酮分泌的机理还不甚了 解遥 本研究通过建立恒河猴睾丸间质细胞渊Leydig 细胞冤体外无血清培养的方法袁观察催乳素对恒河 猴睾丸 Leydig 细胞合成睾酮的影响袁 这对于了解 非人灵长类动物恒河猴睾丸 Leydig 细胞的内分泌 调节机理袁具有一定的价值遥 1材料与方法 1.1试剂McCoy5A 培养基购于 Gibco 公司袁催 乳素尧胶原酶渊Type域冤尧Hepes尧孕烯醇酮尧孕酮和 17琢-羟孕烯醇酮和牛血清白蛋白渊BSA冤购于 Sig鄄 ma 公司袁3
3、H-睾酮及抗睾酮血清由上海内分泌研 究所提供袁 谷氨酰胺由中科院上海生化所提供袁 mCG 由中科院昆明动物所提供遥 1.2实验材料恒河猴睾丸活体组织由卫生部 北京生物制品研究所提供遥 睾丸在动物处死后立 即取出袁放入冰浴的 McCoy5A 培养液袁并在无菌 和 04益条件下袁2 h 内带回实验室遥 1.3睾丸 Leydig 细胞分离和培养咱3暂将取得的 睾丸组织用培养液冲洗数次袁 在玻璃平皿中将睾 丸外周的脂肪和结缔组织等去除袁剥除白膜袁分离 出睾丸实质袁将其拉松尧剪碎袁用 0.1%BSA原Hepes 溶液混合剪碎的睾丸组织袁加入胶原酶袁在 37益消 化 45 min遥 在尼龙滤网上过滤袁离心
4、渊1000 rpm袁 58 min冤收集细胞遥经 BSA 密度梯度重力沉降分 离细胞袁 得到的 Leydig 细胞用培养液离心冲洗 3 次遥 取 20 滋L 的细胞悬液加 20 滋L Trypan bule 染 色遥 用血球计数板确定成活细胞数目袁此时得到的 Leydig 细胞纯度达 95%以上遥 Leydig 细胞按 5 105个辕孔接种到 Linbro24 孔培养板中袁每孔加 0.5 ml McCoy5A 培养液 渊含 L-谷氨酰胺 2 mmol窑 L- 1冤袁 细胞置 37益培养箱培养 渊含 95%空气和 5% CO2冤遥 每 48 h 更换培养液 1 次遥 1.4实验方法连续培养 6
5、d 后袁所用培养液处 理时均先加猴绒毛膜促性腺激素渊mCG冤渊30 滋g窑 mL-1冤袁将培养板随机分组遥 淤 培养液中加入不同 浓度的 PRL曰于 不同剂量孕烯醇酮尧孕酮和 17琢原 羟孕烯醇酮的 渊分别为对照组尧1尧3尧10尧30尧100 nmol 窑 L-1冤加入到培养液中曰盂 培养液中同时加入 不同剂量的 PRL 和不同剂量的孕烯醇酮尧 孕酮和 17琢原羟孕烯醇酮遥 经处理的 Leydig 细胞继续在 催乳素对原代培养恒河猴睾丸间质细胞睾酮合成的影响 王训立 渊福建中医学院动物实验中心袁福建 福州 350108冤 摘要院目的研究催乳素对睾丸间质细胞睾酮生成的调节作用遥方法采用无血清培养
6、方 法分析催乳素对原代培养恒河猴睾丸间质细胞睾酮合成的影响遥结果催乳素可增强恒河猴睾丸 间质细胞对猴绒毛膜促性腺激素渊mCG冤刺激的反应袁睾酮分泌量显著高于 mCG 和催乳素单独作用 时的总和遥 在 mCG 存在下袁催乳素可调节不同的睾酮前身物孕烯醇酮尧孕酮和 17琢-羟孕烯醇酮转化 为睾酮遥 低剂量的催乳素渊员0100 ng 窑 mL-1冤可使一定剂量的睾酮前身物转化为睾酮的量明显增加袁 而高剂量的催乳素渊3001000 ng窑 mL-1冤却明显地抑制睾酮前身物为睾酮袁其中以 17琢-羟孕烯醇酮 的作用最为显著遥结论催乳素对睾丸间质细胞睾酮合成的作用袁可能部分是通过其促进 17琢-羟 孕烯醇
7、酮转化为睾酮来实现的遥 关键词院催乳素曰恒河猴曰睾丸间质细胞曰睾酮 中图分类号院R-332文献标识码院A文章编号院1004-5627渊2009冤04-0047-03 Journal of Fujian University of TCM August 2009袁19渊4冤 福 建 中 医 学 院 学 报2009 年 8 月第 19 卷第 4 期 47 PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 图 1不同培养时间的 Leydig 细胞睾酮合成的水平 图 3孕烯醇酮对 Leydig 细胞睾酮合成的影响 注院与低剂量组比较袁1冤 P0.01 CO2培养箱中培养 48 h袁收
8、集细胞的培养液袁煮沸 15 min袁保存-20益冰箱中待测遥 1.5睾酮的测定培养液中的睾酮含量采用放 射免疫测定法测定遥 培养液中睾酮不需提取直接 测定袁睾酮抗体稀释度为 1颐3105袁灵敏度为37 pg袁批内误差 3.7%袁批间误差 4.2%袁与孕烯醇酮尧 孕酮和 17琢原羟孕烯醇酮的免疫交叉反应分别为 0.5%尧0.1%和 0.05%遥 1.6统计学处理使用 SPSS13.0 软件袁每次实验 重复 3 次袁数据经 t 检验求 P 值遥 2结果 2.1不同培养时间的 Leydig 细胞睾酮合成的水 平在 mCG 的存在下袁连续培养到第 2 天与对照 组没有明显差异袁第 4 天睾酮合成开始增
9、加袁培养 到第 6 天合成量达到高峰袁 继续培养到第 8 天睾 酮合成量逐步下降遥 可见袁随着培养时间的延长袁 出现睾酮合成水平逐渐减少现象遥 因此袁选择连续 培养第 6 天的 Leydig 细胞对外源因素刺激反应性 较好袁见图 1遥 2.2催乳素对 Leydig 细胞合成睾酮的影响在 mCG 存在下袁PRL 对睾酮分泌具有促进作用遥 10尧 30尧100尧300 和 1000 ng窑 mL-1剂量的 PRL 可使细 胞分泌睾酮的量显著高于单用 mCG 或 PRL 时的 睾酮量明显增加遥 但这种增加作用是双相的袁低剂 量的 PRL渊10100 ng窑 mL-1冤促进睾酮合成袁而高 剂量的 PR
10、L渊3001000 ng 窑 mL-1冤却抑制了睾酮合 成袁见图 2遥 2.3催乳素对睾酮前身物转化为睾酮的影响在 mCG 存在下袁低剂量的 PRL渊30 ng窑 mL-1冤促进睾 酮前身物孕烯醇酮尧孕酮和 17琢-羟孕烯醇酮转化 为睾酮袁其中以 17琢-羟孕烯醇酮转化为睾酮的量 最高袁 其次为孕酮袁 再次为孕烯醇酮遥 然而袁在 mCG 存在下袁高剂量的 PRL渊300 ng 窑 mL-1冤对所加 剂量的孕烯醇酮尧孕酮和 17琢-羟孕烯醇酮转化为 睾酮均有抑制作用袁上述现象对 17琢-羟孕烯醇酮 的影响尤为显著袁其次为孕酮袁再次为孕烯醇酮袁 结果见图 3图 5遥 福建中医学院学报第 19 卷
11、图 4孕酮对 Leydig 细胞睾酮合成的影响 注院与低剂量组比较袁1冤 P0.01 辕 辕 图 2催乳素对 Leydig 细胞合成睾酮的影响 注院与对照组比较袁1冤 P0.01袁2冤 P0.05 辕 辕 48 PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 3讨论 催乳素对雄性动物睾丸 Leydig 细胞睾酮合成 的影响在非人灵长类动物中未见报道咱4暂遥 有研究 报道袁给大鼠注射促催乳素分泌的药物袁可使睾丸 中 5琢-还原酶活力升高袁促进睾酮的合成咱5暂遥 但有 离体研究表明袁PRL 虽然对雄激素受体的数量具 有上调作用袁但对 5琢-还原酶的活性无显著影响袁 PRL 对睾
12、酮合成缺乏协同作用袁 这与在体研究的 结果不一致咱6暂遥 本实验采用无血清长期培养的方 法袁在离体的条件下袁研究了催乳素对恒河猴睾丸 Leydig 细胞睾酮合成的影响遥 雄性动物的睾丸 Leydig 细胞是合成雄激素的 主要场所咱7暂遥 睾酮的合成有 2 种途径院一是由胆固 醇侧链断裂开始到合成孕酮的过程曰 二是由孕酮 经 17琢原羟孕酮寅雄烯二酮寅睾酮的转化过程遥 不 同的动物袁其睾酮的合成途径是不一样的袁在这 2 种合成的基本过程中都需要一些关键酶的作用 咱8暂遥 mCG 是一种与人绒毛膜促性腺激素 hCG 在 生理功能上极相似袁 具有灵长类动物 CG 类物质 的特异性的促性腺激素遥 实验
13、证实袁在 mCG 存在 下袁PRL 可增强恒河猴睾丸 Leydig 细胞对 mCG 刺 激的反应袁促进了睾酮合成曰同时袁PRL 促进睾酮 前身物孕烯醇酮尧孕酮和 17琢-羟孕烯醇酮转化为 睾酮袁其中以 17琢-羟孕烯醇酮转化为睾酮的量最 高袁其次为孕酮袁再次为孕烯醇酮袁显示其转化为 睾酮的量与所加入睾酮前身物的剂量成正比遥 说 明 PRL 增加 mCG 刺激 Leydig 细胞睾酮合成可能 是通过孕烯醇酮寅17琢-羟孕烯醇酮寅脱氢表雄 酮寅5-雄烯二醇寅睾酮的生物合成的来实现袁这 与作者前期的研究工作的结果相一致咱9暂遥 本实验用睾酮前身物转化睾酮的结果表明袁 催乳素对睾酮合成为双相调节袁 低
14、剂量时促进睾 酮前身物转化为睾酮袁高剂量时则呈现抑制作用遥 这很可能 PRL 对恒河猴睾丸 Leydig 细胞睾酮合 成的调节过程中某些关键酶如 3茁-脱氢酶尧17琢- 羟化酶尧吟5原4异构酶等的作用有关袁 并且 PRL 可 能是通过改变这些酶的活性而影响睾酮的合成和 分泌咱10暂遥 由此推测袁一方面可能是 PRL 增强了睾 酮合成过程中某些关键酶的活性曰 另一方面可能 是 PRL 增强了 LH 与细胞上 LH 受体的结合能力袁 从而促进了睾酮的生成和分泌遥 至于 PRL 对恒河 猴 Leydig 细胞睾酮合成的确切作用机理还需要进 一步研究遥 致谢院 本研究得到中国科学院动物研究所庄 临之研
15、究员和中国科学院昆明动物研究所邹如金 研究员的大力支持袁特此致谢遥 参考文献院 咱1暂PELLETIER G. Localization of androgen and estrogen receptors in rat and primate tissue 咱J暂. Histol Histopatho1袁2000袁15渊4冤院 1261-1270. 咱2暂王训立袁周建华袁范春梅. 雄性恒河猴生殖功能的季节性变 化咱J暂. 中国兽医学报袁2002袁22渊4冤院375-377. 咱3暂王训立袁庄临之袁李荣皓袁等. 恒河猴睾丸内激素调控的离体 研究 I要恒河猴睾丸 Leydig 细胞的离体培养及激
16、素分泌的 研究咱J暂. 中国实验动物学报袁1998袁6渊1冤院56-60. 咱4暂CHEN H, HARDY M P, ZIRKIN B R. Age-related decreases in Leydig cell testosterone production are not restored by expo鄄 sure to LH in vitro 咱J暂. Endocrinology袁2002袁143渊5冤院1637- 1642. 咱5暂NES W D, LUKYANENKO Y O, JIA Z H, et al. Identification of the lipophilic f
17、actor produced by macrophages that stimulate steroidogenesis 咱J暂. Endocrinology袁2000袁141渊3冤院953-959. 咱6暂祝辉袁于宁妮袁林敏袁等. hCG 对成年小鼠睾丸 Leydig 细胞中 睾酮生成酶的调节作用咱J暂. 解剖学报袁2001袁32渊2冤院146- 150. 咱7暂KELLEY K W, WEIGENT D A, KOOIJMAN R. Protein hor鄄 mones and immunity 咱J暂. Brain Behav Immun袁2007袁21渊4冤院 384-392. 咱8暂
18、SWINNEN E, BOUSSEMAERE M, DENEF C, et al. Stimula鄄 tion and inhibition of prolactin release by prolactin-releasing peptide in rat anterior pituitary cell aggregates 咱J暂. Neuroen鄄 docrinol袁2005袁17渊6冤院379-386. 咱9暂王训立袁李荣皓袁庄临之袁等. 恒河猴睾丸内激素调控的离体 研究芋要雌激素对恒河猴睾 Leydig 细胞睾酮分泌的影响 咱J暂. 中国实验动物学报袁2001袁9渊3冤院189-19
19、2. 咱10暂 LI M, KEISER H D, PEEVA E. Prolactinoma and systemic lu鄄 pus erythematosus院do serum prolactin levels matter 咱J暂. Clin Rheumatol袁2006袁25渊4冤院602-605. 渊下转第 52 页冤 第 4 期王训立院催乳素对原代培养恒河猴睾丸间质细胞睾酮合成的影响 图 517琢-羟孕烯醇酮对 Leydig 细胞睾酮合成的影响 注院与低剂量组比较袁1冤 P0.01 辕 49 PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 Effect of
20、Prolactin on Testosterone Secretion in Cultured Leydig Cells of Rhesus Monkey WANG Xun-li 渊Laboratory Animal Center, FUTCM, Fuzhou, Fujian 350108, China冤 ABSTRACT:ObjectiveTo study the regulatory effect of prolactin on the secretion of testosterone in cultured Leydig cells of rhesus monkey.MethodsTh
21、e effect of prolactin on the secretion of testosterone was analyzed with the method of serum-free medium culture.ResultsProlactin could enhance the stimulat鄄 ing effect of monkey chorionic gonadotrophin (mCG) on testosterone secretion, and the level of testosterone se鄄 cretion stimulated by prolacti
22、n and mCG was significantly higher than the sum of that stimulated by prolactin or mCG respectively. In the presence of mCG, pregnenolone, progesterone and 17琢 -hydroxypregnenolone could be transformed to testosterone by the regulatory effect of prolactin. Low dose of prolactin could promote transfo
23、rmation from a certain dose of testosterone precursors to testosterone, especially 17琢 -hydroxypreg鄄 nenolone, and high dose of prolactin could inhibite the transformation.ConclusionThe effect of prolactin on testosterone secretion in cultured Leydig cells of rhesus monkey is realized through promot
24、ing 17琢-hydrox鄄 ypregnenolone transformation to testosterone. KEY WORDS:prolactin; rhesus monkey; Leydig cell; testosterone 渊上接第 49 页冤 Signal Transduction Mechanism of Resveratrol in Inhibiting Proliferation of Human Lens Epithelial Cell Induced by Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor HU
25、ANG Lu-fen1, HUANG Xiu-rong1, QI Ming-xin2, et al (1. Department of Integrative Medicine, FUTCM, Fuzhou, Fujian 350108, China曰 2. The Second Affiliated Hospital, FUTCM, Fuzhou,Fujian 350003,China) ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the proliferative inhibition of human lens epithelial cell (HLEC) indu
26、ced by recombinant human basic fibroblast growth factor (rhbFGF) by resveratrol (Res) and further study the mechanism of signal transduction in order to provide scientific basis for pursuing safe and effective natural drugs to prevent and cure after cataract.MethodsThe proliferation of HLEC cultured
27、 in vitro were induced by rhbFGF, the inhibition of a certain concentration of Res on the expression of proliferat鄄 ing cell nuclear antigen (PCNA) in proliferative HLEC were detected by flow cytometry (FCM), and the effects of different intracellular signal transduction inhibitor (ie. calmodulin in
28、hibitor W7, protein kinase C inhibitor H7) on its inhibition were detected by FCM.ResultsRes could down-regulate the expression of PCNA in HLEC significantly (P0.01). W7 and H7 could up-regulate the expression of PCNA in HLEC significantly (P0.01).ConclusionRes can inhibit the proliferation of HLEC
29、induced by rhbFGF, and the mechanism may be related to CaM and PKC signal transduction pathway. KEY WORDS:resveratrol; human lens epithelial cell; cell proliferation; inhibition; signal transduction 周期调控相关基因表达的检测咱J暂. 中华眼科杂志袁2002袁38 渊6冤院367-371. 咱5暂卢建袁余应年袁许仁宝. 受体信号转导系统与疾病咱M暂. 济 南院山东科学技术出版社袁1999院8-18. 咱6暂张培霖. 槲皮素对细胞增殖影响的研究进展咱J暂. 泸州医学 院学报袁1999袁22渊2冤院168-170. 咱7暂彭公永袁何志义袁刘启才袁等. 尾加压素域促兔肺动脉平滑肌 细胞增殖及机理探讨咱J暂. 中国病理生理杂志袁2004袁20渊9冤院 1597-1600. 咱8暂张勇刚袁魏睿宏袁李玉光袁等. 尾加压素域促进肾系膜细胞增 殖的细胞内机制研究咱J暂. 汕头大学医学院学报袁2007袁22 渊3冤院132-134. 福建中医学院学报第 19 卷52 PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建
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