光敏化BPDMA后膀胱癌细胞凋亡的研究.pdf
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1、第 30 卷 第 1 期 2006 年 2 月 激 光 技 术 LASER TECHNOLOGY Vol. 30, No. 1 February, 2006 文章编号:1001-3806 (2006) 01-0078-04 光敏化 BPD-MA 后膀胱癌细胞凋亡的研究 许川山1, 吴士明2, 虞乐华3, 王志刚1, 周 媛3, 杨 青4 (1. 重庆医科大学 超声影像学研究所, 重庆 400010; 2. 第三军医大学 新桥医院, 重庆 400037; 3. 重庆医科大学 附属第二 医院 康复中心 激光研究室 重庆 400010; 4. 第三军医大学 西南医院 整形外科中心, 重庆 40003
2、8) 摘要:为了研究光动力抑癌作用机制, 采用流式细胞仪和 TUNEL 法检测激光光敏化 BPD-MA 后人膀胱癌细胞株 BIU-87 细胞凋亡的发生状况。激光光敏化 BPD-MA 后人膀胱癌细胞株 BIU-87 组细胞凋亡发生率明显增高, 许多细胞核 呈棕黄色, 高倍镜下可见细胞核内有大量棕褐色颗粒, 与阳性对照中凋亡细胞核的特征相符合, 而对照组此种细胞少见。 TUNEL 阴性对照中细胞核均呈蓝色。结果表明, 激光激活 BPD-MA 光动力作用明显诱导人膀胱癌细胞株 BIU-87 细胞发 生凋亡, 这可能是其抑癌作用机制之一。 关键词:医用光学与生物技术; BPD-MA; 光动力作用; 膀
3、胱癌细胞; 细胞凋亡 中图分类号:R730. 57 文献标识码:A Apoptosis of human bladder cancer BIU-87 cells after photodynamic therapy with laser-activated BPD-MA determined with TUNEL assays XU Chuan-shan1, WU Shi-ming2, YU Le-hua3, WANG Zhi-gang1, ZHOU Yuan3, YANG Qing4 (1. Institute of Ultrasound Imaging, Chongqing Univers
4、ity of Medical Sciences, Chongqing 400010, China; 2. Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China; 3. Department of Laser Research, Rehabilitation Center, Second Affiliated Hospital, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400010, China; 4. Center of Plast
5、ic Surgery, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China) Abstract:In order to study the mechanism of photodynamic therapy on malignant tumors, photosensitization of BPD-MA is activated by laser with red light (632. 8nm)delivered at 10mW/ cm2to give a total dose of
6、2. 4J/ cm2. Apoptosis of human bladder cancer BIU-87 cells is determined with flow cytometry with PI staining and terminal deoxyuridine nick end labeling(TUNEL) assays. Results show that photodynamic therapy with BPD-MA significantly increases the rate of apoptosis in BIU-87 cells. A lot of the posi
7、tive cells in which their nucleus is brown-yellow fine particle shape or overflowing-dispersed are observed after treatment of cells with photodynamic therapy with BPD-MA. However, laser irradiation alone, BPD-MA alone and sham radiation without BPD- MA can not affect apoptosis of human bladder canc
8、er BIU-87 cells. A conclusion can be made that treatment of cells with photodynamic therapy obviously induces human bladder cancer BIU-87 cells to apoptosis, which may be one of the important mechanism of photodynamic therapy on malignant tumors. Key words:medical optics and biotechnology; BPD-MA; p
9、hotodynamic therapy; bladder cancer; apoptosis 基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (30300468) ; 军队 医药卫生十五科学基金资助项目 (01Q102) 作者简介: 许川山 (1972-) , 男, 副研究员, 博士后, 主要研 究方向为光动力研究基础及应用研究。 E-mail: xcshan163. com 收稿日期: 2004-12-16; 收到修改稿日期: 2005-01-25 引 言 光动力治疗 (photodynamic therapy, PDT) 是随着 光纤技术、 激光医学和内镜技术发展而兴起的一种治 疗恶性肿瘤的新方法,
10、 已在治疗支气管、 膀胱和皮肤等 部位的肿瘤方面表现出良好的应用前景, 但是光动力 抑癌作用机制有待进一步阐明 1, 2。本试验选择人膀 胱癌细胞株 BIU-87 细胞作为研究对象, 应用流式细胞 仪和脱氧核苷酸转移酶介导 dUTP 切口末端标记技术 原位 (TdT-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL) 观 察了激光激活新型光敏剂苯并卟啉衍生物单酸环 A (benzoporphyrin derivative monoacid ring A, BPD-MA) 光动力作用对人膀胱癌细胞株 BIU-87 细胞凋亡的影 响, 旨在进一步了解光动力抑癌作用的生物
11、学机制。 1 实验材料与方法 1. 1 主要试剂及配制 光敏剂 BPD-MA 是加拿大 QLT 公司产品。碘化 丙啶 (PI) 是 Sigma 公司产品, 以 PBS 配制成 50g/ mL 的 PI 染液。小牛血清、 胰蛋白酶、 RPMI1640 细胞培养 基为美国 Hyclone 公司产品。TUENL 试验盒为武汉博 士德生物工程有限公司产品。DAB 显色剂配制是 第 30 卷 第 1 期许川山 光敏化 BPD-MA 后膀胱癌细胞凋亡的研究 DAB 5mg, 0. 01N PBS 10mL (pH7. 4) , 用前过滤, 用 30%的 H2O2稀释至 0. 02%。HEPES 是德国 B
12、iomol 公司产品。 1. 2 细胞培养 人膀胱癌细胞株 BIU-87 (由北京大学泌尿外科研 究所分离并建株, 第三军医大学西南医院感染科邓国 宏博士惠赠) 在含 10%小牛血清的 RPMI 1640 细胞培 养液中, 置于 37, 5% CO2孵育箱中常规细胞培养、 传代。 1. 3 实验分组及光动力处理 将对数生长期的 BIU-87 细胞随机分成实验前对 照组和实验组。实验组包括 BPD-MA 光动力实验组 (加光敏剂, 照光) 、 单纯激光照射对照组 (不加光敏 剂, 只照光) 、 单纯 BPD-MA 对照组 (只加光敏剂, 不照 光) 和空白对照组 (不加光敏剂的假照射组, 除不加
13、光 敏剂和照光能量密度为 0J/ cm2外, 其余处理条件与光 动力实验组一致) 。每组设 3 复孔, 换液后光动力实 验组及单纯光敏剂对照组在暗室中加入终浓度为 625ng/ mL 的 BPD-MA, 单纯激光照射对照组和空白对 照组加入等量不含小牛血清的 RPMI1640 培养液, 置 于 37, 5% CO2孵育箱中孵育 90min, 去掉含 BPD- MA 的 RPMI1640 培养液, 用 D-Hanks 缓冲液 (去酚 红) 冲洗两遍后, 再换成新的含 10% 小牛血清 RP- MI1640 培养液, 将培养板放置于 37恒温水浴槽, 光 动力实验组及单纯激光照射组使用 632.
14、8nm He-Ne 激光照射 (HN-3 型, 北京科学仪器厂产品, 输出功率 为 0mW 100mW 连续可调, 光导纤维连续输出) 。调 整激光功率和光斑面积使细胞实际接受到光功率密度 为 10mW/ cm2, 使激光通过光导纤维均匀垂直地照射 到细胞培养板, 使各组细胞实际接受到的光能量密度 达到 2. 4J/ cm2。照射前后监测激光输出功率的变化, 控制其变化幅度小于 5%。照射后置 37, 5% CO2孵 育箱中连续培养 24h, 进行以下指标检测。 1. 4 流式细胞仪检测细胞凋亡率 选取对数生长期的人膀胱癌细胞株 BIU-87, 制成 单细胞悬液, 按 5 104/ mL 接种
15、于 24 孔培养板, 继续 培养 12h 后进行分组及光动力处理。各组细胞经实验 处理后置于 37, 5%CO2孵育箱中继续培养 8h, 收集 细胞, 70%冷乙醇固定: 置细胞于 0. 1mL PBS 缓冲液 中, 用注射器迅速注入 4 冷乙醇中, 边注射边振摇, 以防细胞成团, 把细胞贮存于 4冰箱中至少 12h, 检 测时 1500r/ min 离心 5min, 弃乙醇, 用 PBS 缓冲液洗 涤 2 次, 悬细胞于 0. 5mL PBS 缓冲液中, 加入 RNase A (每样品约3000 活性单位) 37冰浴中孵育30min 后, 立即放入冰浴中, 终止RNaseA的作用, 加入0.
16、 5mL PI 染色 (50g/ mL) 行 DNA 染色, 样品保存在黑暗处, 至少染色 30min, 上机前用大于 100目的尼网过滤。上 机检测, 用 CellQuest 软件进行分析。 1. 5 TUNEL 法检测细胞凋亡 TUNEL 法按细胞凋亡检测试剂盒使用说明书所 示操作方法进行 DNA 末端标记, 具体方法如下: 经 4%多聚甲醛固定好的样本片, PBS 缓冲液洗 2min 2 次, 蒸馏水洗涤 2min 2 次0新鲜配制 3% H2O2, 室温 处理 10min, 蒸馏水洗涤 2min 3 次0标本片加 TBS 1:100新鲜稀释 Proteinase K, 37消化 3mi
17、n, 蒸馏水洗 涤 2min 3 次0加标记缓冲液 (labeling buffer) 20L / 片, 以保持切片湿润, 按每张切片取 TdT 和 DIG-d-UTP 各 1L, 加入 18mL 标记缓冲液中, 混匀, 甩去玻片上 多余液后加标记液 20L/ 片, 置标本片于湿盒中, 37 标记 2h0TBS 液洗 2min 3 次0加封闭液 50L/ 片, 室温 30min, 甩掉封闭液, 不洗0用封闭液 1:100 稀释 生物素化抗地高辛抗体 50L/ 片加至标本片上, 置于 湿盒中, 37反应 30min, TBS 液洗 2min 4 次0每张 载玻片加入 50L 100L DAB 显
18、色液, 室温 15min0 苏木素复染 45s, 自来水冲洗, 室温下干燥 24h, 透明, 封片, 光子显微镜下观察细胞核呈棕黄色者为阳性细 胞, 细胞核为蓝色者是阴性细胞, 同时设立阳性对照和 阴性对照; 阳性对照每张片滴加 100L DNase I (1mg/ mL) , 室温下放 置 10min, 操 作 同 上, 阴 性 对 照 用 TUNEL 标记液替代反应混合液, 其余操作同上。 2 结 果 应用流式细胞仪定量检测到光敏化 BPD-MA 后 人膀胱癌细胞株 BIU-87 的凋亡发生率从对照组的 (5. 28 1. 49) % 显著增加到 (26. 11 2. 59) % (P 0
19、. 01) , 而对照组间比较差异不明显。同时 TUNEL (POD) 法染色, 光学显微镜下观察到光敏 BPD-MA 后 人膀胱癌细胞株 BIU-87 组许多细胞核呈棕黄色, 高倍 镜下可见细胞核内有大量棕褐色颗粒, 与阳性对照中 凋亡细胞核的特征相符合, 而对照组此种细胞少见。 TUNEL 阴性对照中细胞核均呈蓝色 (见图 1 图 4) 。 Fig. 1 TUNEL-positive control 97 激 光 技 术2006 年 2 月 Fig.2 TUNEL-negative control Fig. 3 TUNEL staining 8h post photodynamic the
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