八肽缩胆囊素对脂多糖诱导血管内皮细胞诱生型一氧化氮合酶表达变化的抑制作用.pdf
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1、论著 八肽缩胆囊素对脂多糖诱导血管内皮细胞 诱生型一氧化氮合酶表达变化的抑制作用 闫骏谷振勇王杏云刘森徐小虎丛斌凌亦凌 【摘要】 目的探讨八肽缩胆囊素( C C K 8 )对脂多糖( L P S )诱导血管内皮细胞诱生型一氧化氮合酶 ( i NOS )表达变化的影响。方法 培养人脐静脉内皮细胞株E C V 3 0 4细胞,用0 . 0 1 、 0 . 1和1mg / LL P S处理 2 2 4h ,用生理盐水、 1 0 -7mo l / LC C K 8和0 . 1mg / LL P S +1 0 -6、 1 0-7、 1 0-8mo l / LC C K 8处理1 6h ;用 比色法检测培
2、养液中一氧化氮( NO)含量、细胞NOS活性,免疫细胞化学及蛋白质免疫印迹法检测i NOS蛋 白表达。结果与生理盐水处理的对照组比较, L P S诱导培养液NO含量增多、细胞NOS活性增高、 i NOS蛋 白表达上调; C C K 8剂量依赖性抑制L P S的上述效应,而单独作用对i NOS蛋白表达、 NOS活性和NO含量 均无明显影响。结论 C C K8可以明显抑制L P S引起E C V3 0 4细胞i NOS蛋白表达上调, 减少NO生成。 【关键词】 八肽缩胆囊素;脂多糖;一氧化氮合酶;血管内皮细胞 I n h i b i t o r ye f f e c t o f c h o l e
3、 c y s t o k i n i no c t a p e p t i d e o nl i p o p o l y s a c c h a r i d e e l i c i t e di n d u c i b l e n i t r i c o x i d e s y n t h a s e e x p r e s s i o ni nv a s c u l a re n d o t h e l i a l c e l l s Y AN J u n *,G UZ h e n y o n g ,WANGXi n g y u n ,L I US e n ,XU Xi a oh u , C
4、 O NG B i n , L I NG Y il i n g . * De p a r t me n to f F o r e n s i cMe d i c i n ea n d P a t h o p h y s i o l o g y , He b e i Me d i c a lUn i v e r s i t y , S h i j i a z h u a n g ) * ) ) + , , He b e i , C h i n a ( Y AN J u n -o r . sa tDe p a r t me n to f P a t h o p h y s i o l o g y
5、,Na n . a i Ho s p i t a l ,/ i a n j i n0 ) ) + ) ) ,C h i n a ) C o r r e s p o n d i n ga u t h o r 1G UZ h e n y o n g( 2 ma i l 1z h e n y o n g 3 3 4s o h u . c o m) 【 5 b s t r a c t 】6 b 7 e c t i v e8 o i 9 : ; = ;= h ; ? ? ; =o ? h o l ; A C ; C = i D ;( C C K8 )o 9 l i C o C o l A h E i D
6、 ;( L P S ) ; l i i = ; Di 9 D F i G l ;9 i = E i o H i D ; E; 9 D o = h ; l i l ; l l 9F mG i l i l : ; i 9; 9 D o = h ; l i l ; l l l i 9 ;( E C V3 0 4 ; l l = ; DKi = h: ; h i l ; ( 9 o E m l l i 9 ; )o EL P S i 9= h ;C E ; G 9 D ; l l F l E9 i = E i o H i D ; = i : i = AK; E ; D ; = ; E mi 9 ; D
7、 Ki = h l l A . 8 h ;i NOS ; H C E ; l = ; h 9 i L F ; 9 D M; E ; D Ki = h 9 o E m l l i 9 ; , L P S 9 = l A i 9 D F ; D = h ; F C E ; g F l = i o 9o ? i NOSC E o = ; i 9; H C E ; 9 DNOS = i : i = Ai 9E C V3 0 4 ; l l 9 DNOl ; : ; l i 9 F l = F E ; Dm; D i K; E ;i 9 E ; G o : ; m; 9 = i o 9 ; D; ? ?
8、 ; = o ? L P S i 9D o 9 9 ; E .Mh ; E ; l o 9 ;D i D9 o = 9 D ; l l F l ENOS = i : i = A E ; DKi = h= h o l F ; 9 DNOC E o D F = i o 9i 9E C V3 0 4 ; l l C ; C = i D ; ;l i C o C o l A h E i D ; ;9 i = E i o H i D ; E ; 9 D o = h ; l i l ; l l 基金项目1河北省自然科学基金资助项目( 3 0 1 3 R 1 ) ;教育部重点 项目基金资助( 2 0 4 0
9、 1 6 ) 作者单位1 0 R 0 0 1 7石家庄,河北医科大学法医学与病理生理学 教研室S闫骏(现在天津市南开医院病理科工作) ,谷振勇,王杏云,刘 森,丛斌,凌亦凌T ; R 1 R 0 3 1广东汕头,汕头大学医学院(徐小虎) 通 讯作者1谷振勇,医学博士,教授,博士研究生导师( E m i l 1 U h ; 9 A o 9 g 8 8 4 i l 1 A 9 h F 9 g 2 41 6 3 . o m) 。 研究发现,血管内皮细胞不仅构成血管的机械 性保护屏障,还可合成多种血管活性物质如一氧化 氮( NO) ,调节血管的张力和反应性变化S 1 T。已经证 实, NO是内皮衍生舒
10、血管因子( E W X Y )的主要化学 物质,一氧化氮合酶( NOS )是 NO生成的限速酶。 在生理条件下,内皮细胞主要存在内皮型一氧化氮 合酶( ; NOS ) , NO生成量较少,主要发挥调节血管 张力、防止血小板黏附等生理功能;而当内毒素脂多 糖( L P S )及促炎细胞因子等刺激血管内皮细胞时, 可诱导血管内皮细胞诱生型一氧化氮合酶( i NOS ) 表达上调, NO生成量明显增多。过量生成的NO及 其衍生物过氧亚硝基阴离子均具有细胞毒效应,可 导致细胞损伤。在内毒素休克发病过程中,血管内皮 细胞NO的生成、释放及其生物学效应异常是血管 内皮细胞损伤和内皮功能异常的关键环节S 2
11、 , 3 T。保护 血管内皮已经成为治疗休克的重要途径。 八肽缩胆囊素( C C K 8 )是一种分布广泛的神 经调节肽,具有抗休克、缓解内毒素休克血管动力学 6V 中国危重病急救医学2 0 0 6年2月第1 8卷第2期 C h i 9C E i = C E ;Z; D , Y ; G E F E A2 0 0 6 , Vo l . 1 8 , No . 2 紊乱和细胞保护作用 3 。我们以往研究发现, C C K 8 对内毒素休克时肺循环和体循环血管或内毒素处理 离体血管的张力和反应性变化具有明显的调节作 用,可改善NO介导的血管内皮依赖性舒张反应降 低 4 ,抑制L P S诱导的肺动脉内皮
12、细胞凋亡,减少 NO衍生的强效氧化剂和硝基化因子过氧亚硝基阴 离子的生成 5 ,提示C C K 8的作用可能与其改变 血管内皮细胞的NO生成、释放或生物学效应有关。 迄今为止, C C K 8对血管内皮细胞NO生成变化 及NOS的影响尚未见报道。本实验中在细胞水平 观察 C C K8对L P S诱导人脐静脉内皮细胞株 E C V3 0 4细胞i NOS变化的调节作用, 探讨C C K 8 缓解内毒素休克血管动力学紊乱、减轻血管内皮依 赖性舒张反应降低的分子机制。 1 材料与方法 1 . 1 药品及试剂: C C K 8和L P S为S i g ma产品; 细胞培养液 R P MI 1 6 4
13、0为G I B C OB R L产品; NO和NOS试剂盒为南京建成生物公司产品; 兔抗 人i NOS多克隆抗体(一抗)为美国S a n t aC r u z公司 生产;辣根过氧化物酶( HR P )标记的山羊抗兔I g G (二抗)为美国Ve c t o r公司生产;免疫组化试剂盒和 3 , 3 二氨基联苯胺( D AB )显色试剂盒均为北京中 山生物公司生产;其他试剂均为国产分析纯。 1 . 2 细胞培养及预处理:人脐 静 脉 内 皮 细 胞 株 E C V3 0 4细胞购自武汉大学动植物特殊菌种保藏 中心。细胞复苏之后,用R P MI 1 6 4 0完全培养液 (含体积分数为1 0 %的
14、胎牛血清、 1 0 0k U/ L青霉 素、 1 0 0k U/ L链霉素)将细胞数调为1 1 0 9/ L , 接 种于2 5ml培养瓶中,在3 7、体积分数为5 %的 C O2和9 5 %的O2条件下培养, 3d传代1次。 细胞传代后3 6 4 8h ,当细胞长至培养瓶的 8 0 %9 0 %时开始给予刺激因素。细胞分为4组: 溶剂对照组(对照组) :培养液中加入生理盐水; L P S组: 培养液中加入终浓度分别为0 . 0 1 、 0 . 1和 1mg / L的L P S ; C C K 8组:培养液中加入终浓 度为1 0 -7mo l / L的 C C K8 ; L P S +C C
15、K8组: 在培养液中同时加入终浓度分别为1 0 -6、 1 0-7和 1 0 -8mo l / L的 C C K8和0 . 1mg / L的L P S 。L P S 组动态观察2 2 4h ,其余各组观察1 6h ,每个时间 点4个复孔。 1 . 3 细胞培养上清的收集及细胞匀浆制备:将细胞 培养液以8 5 0 g离心3mi n ,收集上清于试管中, 置于 7 0超低温冰箱中冻存备用;收集细胞,以细 胞裂解液 0 . 1mmo l / LT r i s HC l缓冲液, p H 7 . 4 , 0 . 1mmo l / L乙二胺四乙酸( E D T A) , 0 . 5mmo l / L 二硫
16、苏糖醇( D T T) , 0 . 1mmo l / L乙二醇四乙酸酯 ( E G T A) , 1 mo l / L抑胃肽A, 1mmo l / L苯甲基磺 酰 氟( P MS F ) , 2 mo l / L亮抑胃蛋白酶肽裂解细 胞,冰浴中超声破碎细胞,于4、 2 00 0 0 g离心 6 0mi n ,上清为细胞匀浆,细胞匀浆蛋白含量用考马 斯亮蓝法检测。 1 . 4 观察指标 1 . 4 . 1 细胞NOS活性及上清NO含量检测:采用 试剂盒检测,操作按说明书进行。NOS活性以每克 蛋白中NOS活性( k U/ g )表示, NO含量以 NO的 代谢产物NO - 2/ NO - 3 表
17、示。 1 . 4 . 2 免疫细胞化学检测i NOS蛋白表达:按照免 疫组化试剂盒说明书操作。E C V 3 0 4细胞于盖玻 片上贴壁生长,加入前述药物处理细胞。用体积分数 为9 5 %的乙醇固定3 0mi n ,体积分数为3 %的过氧 化氢( H2O2)室温孵育细胞爬片1 0mi n ,以消除内源 性过氧化物酶活性。蒸馏水冲洗, 0 . 0 1mo l / L磷酸 盐缓冲液( P B S , p H 7 . 4 )洗5mi n 。正常血清工作液 孵育细胞爬片1 5mi n ,以减少非特异性染色,然后 倾去液体、勿洗。滴加用0 . 0 1mo l / LP B S ( p H 7 . 4 )
18、 1 :1 0 0稀释的一抗, 4过夜。0 . 0 1mo l / LP B S ( p H 7 . 4 )洗3次,每次3mi n 。滴加生物素标记的二 抗, 3 7孵育1 5mi n , 0 . 0 1mo l / LP B S ( p H 7 . 4 )洗 3次,每次3mi n 。滴加HR P标记的链霉卵白素工作 液, 3 7孵育1 5mi n 。0 . 0 1mo l / LP B S( p H 7 . 4 ) 洗3次,每次3mi n 。 D AB显色5mi n ,达到要求颜色 深度时,以蒸馏水/自来水终止显色,中性树胶封片。 阴性对照用P B S代替一抗,其余步骤同上。 i NOS免
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