六价铬对L-02肝细胞线粒体功能的影响.pdf
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1、9 1 8实用预防医学 2 0 0 4 年t o 月 第1 1 卷 第5 期 P r a c t i c a l P r e v e n t iv e M e d i c i n e , O c t . 2 0 0 4 , V o l I I , N o . 5 文章编号: 1 0 0 6 一 3 1 1 0 ( 2 0 0 4 ) 0 5 一 0 9 1 8 一 0 4【 论著 】 六价铬对 L 一 0 2 肝细胞线粒体功能的影响 肖经纬, 钟才高, 张洪霞 摘要: 目的探讨六价铬( C r ( V I ) ) 对肝细胞线粒体与凋亡密切相关功能的影响。方法选取2 , 4 , 8 , 1 6
2、, 3 2 , 6 4 p m o 1/ L 6 个不同 浓 度的C r ( V I ) 溶液 处 理L - 0 2 人 胚 肝 细 胞6 h , 采用M T T 法检 测细 胞 活力 和 线 粒体 酶抑 制 率; 荧 光 分光 光 度 法 检 测 线粒 体膜 通透 性 转 运 孔( P T P ) 的开放程度和 线粒 体膜电 位的( 恤) 的 变化。 结果 在2 . 6 4 I Cm o l/ L C r ( V I ) 处理浓度, C r ( V I ) 对L 一 0 2 肝细胞具有明显的细胞毒性, 其细胞存活率与C r ( V I ) 处理浓度呈负相关( 相关系数r =一 0 . 9 1
3、 0 ) 。随着C r ( V I ) 浓度的增加L 一 0 2 肝细胞线粒体总酶活性受到抑制; 线粒体P T I 孔开放程度增加; 线粒体膜电位 ( 伽) 降低, 且与对照组比 较均具有显著性差异( P 0 . 0 5 ) 。 结论 C r ( V I ) 可对L - 0 2 肝细胞线粒体与凋亡相关的功 能产生损伤效应。 关键词:六价铬; L 一 0 2 人胚肝细胞; 线粒体; 膜通透性转运孔; 膜电位; 线粒体酶 中图分类号: R- 3 3文献标识码: A Th e Ef f e c t 月o n g一x i a o f H e x a v a l e n t C h rom i u m
4、o n L一0 2 H e p a t o c y t e Mi t o c h o n d r i a X I A O J i n g一” T iC a i 一g a o ,Z H A N G D e p a r t m e n t o f H e a l t h T o x i c o l o g y ,X i a n g y a S c h o o l o f P u b l i c H e a l t h ,C e n t r a l S o u t h U n i v e r s i t y , C h a n g s h a 4 1 0 0 7 8 , C h i n a ) A
5、b s t r a c t : ( ) 场 e c t i v e T o e x p lo r e t h e e ff e c t o f h e x a v a le n t c h r o m iu m o n t h e f u n c t io n s o f L 一 0 2 h e p a t o c y t e s m it o c h o n d r ia w h ic h a r e in c lo s e r e la t io n s h i p w it h a p o p t o s is . M e t h o d s T h e e ff e c t s o f
6、 C r ( V I ) o n cel l s u r v iv a l r a t e w e r e a s s e s s e d o n t h e r e d u c t io n s o f t e t r a z o l iu m d y e ( M T T ) in c u lt u r e d h e p a t o c y t e s . L 一 0 2 h e p a t o c y t e s in a ll t e s t s w e r e in c u b a t e d w it h 2 , 4 , 8 , 1 6 , 3 2 , 6 4 u m o l/ L
7、 c o n cen t r a t io n s o f C r ( V I ) f o r 6 h a c c o r d in g t o s u r v iv a l r a t e . T h e p e r m e a b i lit y t r a n s it io n p o r e ( P T P ) o f m it o c h o n d r ia , m it o c h o n d r ia l m e m b r a n e p o t e n t ia l a n d t h e in h ib it r a t e o f m it o c h o n d r
8、 ia l e n z y m e a s in d ic a t o r s o f m it o c h o n d r ia l d a m a g e w e r e m e a s u r e d b y f lu o r e s cen t s p e c t r o m e te r a n d t h e r e d u c t io n s o f t e t r a z o liu m d y e ( M T T ) , r e s p e c t iv e ly . R e s u l t s C r ( V I ) r e s u lt - e d in s e v e
9、 r e c y t o t o x ic it y o f L 一 0 2 h e p a t o c y t e s . C o n c e n t r a t io n 一 d e p e n d e n t d e c r e a s e in cell s u r v iv a l r a t e o f C r ( V I ) 一 t r e a t e d L 一 0 2 h e p a t o c y t e s w e r e o b s e r v e d . T h e r e la t i o n s h i p b e t w e e n c o n cen t r
10、a t io n a n d s u r v iv a l r a t e w a s s ig n if ic a n t n e g a t iv e c o r r e la - t io n ( r =一 0 . 9 1 0 ) . T h e r e s u lt s o f p e r m e a b i l it y t r a n s it io n p o r e ( P T P ) o f m it o c h o n d r ia , m it o c h o n d r ia l m e m b r a n e p o t e n t ia l a n d t h e
11、in h ib it r a t e o f m it o c h o n d r ia l e n z y m e in a ll c o n cen t r a t io n s o f C r ( V I ) h a d s ig n if ic a n t d iff e r e n ce c o m p a r e d t o t h e c o n t r o l cells ( P 0 . 0 5 ) . C o n c l u s io n T h e r e s u lt s d e m o n s t r a t e d t h a t C r ( V I ) in d u
12、 ced L 一 0 2 h e p a t o c y t e s m it o c h o n d r ia l d a m a g e s r e la t e d t o a p o p t o s is . K e y w o r d s : H e x a v a le n t c h r o m iu m ; L 一 0 2 h e p a t o c y t e ; M it o c h o n d r ia p e r m e a b ilit y t r a n s it io n p o r e( P T P) ; M e m b r a n e p o t e n t
13、ia l ; Mit o c h o n d r ia l e n z y m e 铬是环境中常见的重金属污染物, C r ( I I I ) 由于不易通过细 胞膜而被认为基本无毒 。 C r ( V I ) 能通过细胞膜特异性离子 通道进人细胞内, 并在细胞内还原过程中产生活性氧族( r e a c - t i v e o x y g e n s p e c i e s , R O S ) 即含氧自由基( o x y g e n - d e r iv e d f r e e r a d i c a ls ) 如超氧阴离子( 汀一 ) 、 经自由基( “ O H ) 、 过氧化氢 ( H z
14、O z ) 等及一系列中间产物而造成细胞的程序性死亡即凋亡 ( a p o p t o s is ) z 7 。 肝 脏 是C r ( V I ) 作用的 主 要 毒 作 用 靶器 官, 肝细 胞线粒体不仅是体内的能量加工厂, 而且在决定细胞的生存或 作者单位: 中 南大学湘雅公共卫生学院毒理学系( 湖南 长沙 4 1 0 0 7 8 ) 作者简介: 肖 经纬( 1 9 7 8 一 ) , 女, 北京市人, 在读硕士, 研究方向: 分子毒 理学。通讯作者: 钟才高( 1 9 5 4 一) , 男, 教授, 硕士、 博士生导师。 死亡方面也起到非常重要的作用。线粒体损伤与细胞凋亡密 切相关 3
15、, 其损伤后的功能改变往往表现为膜电位的降低、 膜 的不稳定增加、 P T P 孔开放以及多种酶活性的降低或丧失。已 知活性氧( R O S ) 的过度积累可造成细胞内氧化和抗氧化的不平 衡状态即氧化应激, 引起细胞膜、 线粒体膜等膜结构的氧化损 伤, 或使线粒体内的氧化还原电子传递链紊乱, 破坏细胞的动 态 平 衡, 危 及 细 胞的 生 命活 动 闭。 另 一 方面, 线粒体 膜 通透 性 转运孔( P T P ) 的开放能够导致线粒体跨膜电位( 伽) 的改变, A T 生成减少, 也可促进R O S 产生5 .G 。 故本次实验重点在于 探讨C r ( V I ) 对L 一 0 2 人胚
16、肝细胞线粒体与凋亡相关功能的影 响, 为深人探讨C r ( V I ) 通过诱导生物机体氧化损伤所致细胞凋 亡的机制提供部分实验依据。 万方数据 实用预防医学 2 0 0 4 年1 0 月 第1 1 卷 第5 期 P r a c t i c a l P r e v e n t iv e Me d ic i n e , O c t - 2 0 0 4 , V o l 1 1 , N o . 59 1 9 1 . 1 材料与方法 材料 1 . 1 . 1 细胞系L 一 0 2 人胚肝细胞株( 简称L 一 0 2 肝细胞) , 购自 武汉大学典型培养物中心。 1 . 1 . 2 主要试剂重铬酸钾(
17、K z C r z g, 分子量2 9 4 . 1 9 , 上海 浦江化工厂, 基准级, 含量9 9 . 8 %以上) ; 胰蛋白酶( D i f c o 公司, 美国) ; D M E M 培养基( G I B U 公司, 美国) ; 新生胎牛血清 ( G I B C ( ) 公司, 美国) 。噬陛蓝( M T T , A m r 、 公司, 美国) ; 二 甲 基亚矾( D M S O , S ig m a 公司, 美国) ; 罗丹明1 2 3 ( R h 1 2 3 , S ig m a 公司, 美国) ; H E P E S ( A M E R S H A M公司, 美国) ; 曲拉通
18、X 一 1 0 0 ( T r i t o n 一 X 1 0 0 , S ig m a 公司, 美国); 蔗糖、 *M酸钠、 磷酸二氢 钾、 异丙醇等均为市售分析纯。 1 . 1 . 3 主要仪器MK 3型酶标仪( T h e r m o 公司, 美国) ; 9 6 0 M C 型荧光分光光度计( L E N G G U A N G公司, 美国) ; %孔 培养板及6 孔培养板( C o s t a r 公司, 美国) ; H H C P 一 1 型二氧化 碳细胞培养箱( 上海一恒科技有限公司) ; X l ) 一 1 0 1 型倒置生物 显微镜( J N O E C公司, 美国) ; F
19、o r m a T 2 5 超低温冰箱( 一 8 0 C, 美国) ; T D Z 5 一 4 . 0 型多管架自 动平衡离心机( 长沙天创仪器制 造有限公司) ; G L - 2 A型全自动高速冷冻离心机( 湖南仪器仪 表总厂科学仪器厂) ; O l y m p u s 普通双目 光学显微镜等。 1 . 2 方法 1 . 2 . 1 L - 0 2 肝细胞培养按常规细胞培养法培养L - 0 2 肝 细胞, 所用培养基为含 1 0 %胎牛血清的D ME M培养基, 置于 5 %二氧化碳培养箱中培养, 每2 一3 d 用0 . 2 5 %的胰酶消化并 传代一次。 1 . 2 . 2 L - 0
20、2 肝细胞生存率测定取处于对数生长期的L 一 0 2 肝细胞, 用0 . 2 5 %胰蛋白酶消化, 离心去上清后加人2 m l 含1 0 % 胎牛血清的D ME M培养基稀释, 充分吹打成单细胞悬 液, 取少许滴在细胞计数板的一侧, 盖上盖玻片, 显微镜下观察 计数, 调整细胞密度为1 一 2 x 104/ml.以每孔2 0 0 u l 单细胞 悬液接种于 % 孔培养板, 过夜后更换新鲜培养基, 培养 2 4 h 后, 设6 个浓度组即2 , 4 , 8 , 1 6 , 3 2 , 6 4 fu n o l/ L 和一个空白 对照 组, 6 个浓度组所有孔内 取出5 川培养基, 分别加人0 .
21、 0 8 , 0 . 1 6 , 0 . 3 2 , 0 . - 6 4 , 1 . 2 8 , 2 . 5 6 u m o l/ L k 2 C r 2 O , 溶液 各5 l , 每 组6 个复 孔。 培养板继续在3 7 5 % C O 2 及饱和湿度条件下培养6 h ( 换用无血清培养基后) , 每孔吸掉2 0 u l 培养基, 加人5 m g / m l M T T 2 0 u l , 继续孵育4 h , 小心吸掉培养基, 每孔加人 1 5 0 u l 二 甲基亚矾( D M S O ) , 振荡 1 0 m i n 使结晶物充分溶解。用 MK 3 型酶标仪, 于4 9 0 n m处测
22、吸吸光度( A ) , 计算其平均值。用下 清) , 其 余组 依次加人0 . 0 8 , 0 . 1 6 , 0 . 3 2 , 0 . 6 4 , 1 . 2 8 , 2 . 5 6 m m o l/ L k 2 C r 2 C y 溶液 各5 0 讨及1 . 9 5 闪D ME M培 养基( 不 含 胎牛 血 清) , 继续培养6 h o制备线粒体: 细胞消化吹打成单细胞悬 液后用2 m l P B S 洗一次, 离心去上清, 加含2 5 0 m m o l/ L 蔗糖的 细胞裂解液3 耐, 吹打均匀后于4 4 0 0 0 r / m in 离心1 0 m i n , 取上清再于4 1
23、0 0 0 0 洲 m in 离心 1 5 m in , 所得沉淀即为线粒 体, 加入3 m l 测定介质P ( 2 5 0 m m o l/ L蔗糖、 2 m m o l/ L H E P E S , 0 . 5 m m o l/ L K H Z P O , , 4 . 2 m m o l/ L AM酸钠) , 吹打均匀即成线 粒体悬液。然后定量测定线粒体蛋白含量, 使各组含量基本一 致。将上述线粒体悬液移人石英杯中, 发射及激发波长均为 5 2 0 n m, 温度2 5 , 在9 6 0 M C型荧光分光光度计上测定吸吸 光度( 氏2 0 ) 。计算P T P 开放度( %) : P T
24、P 开 放 度 ( %)= 对照组吸光度值一染毒组吸光度值 对照组吸光度值 1 0 0 %。 ” 1 . 2 . 4 线粒体酶活力测定细胞预处理及染毒同P T P 孔 检 测。 细胞染毒6 h 后每孔吸去2 0 0 闪培养基后, 加人2 0 0 tL L M T T ( 5 m g / m L ) , 继续培养4 h 后, 将细胞消化, 并用P B S 吹 打成2 m l 细胞悬液, 1 5 0 0 订 m in 离心1 0 m in , 弃上清后沉淀加 0 . 4 m l 酸性异丙醇, 混匀并静置2 0 m i n , 取1 0 0 川上清液加于 9 6 孔板上, 每组重复4 个复孔。M K
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