六种支原体单克隆抗体的制备与鉴定.pdf
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1、基金资助: 国家自然科学基金资助项目 (30130190) ; 北京市自 然科学基金资助项目 (7012007) 作者单位: 100034 北京大学临床肿瘤学院北京市肿瘤防治研究 所 杨文君 (现工作单位: 宁夏医学院) 、 张建芝、 寿成超 ; 宁夏医学 院 (李燕、 张艳丽) *同为第一作者 通讯作者: 寿成超, 电子信箱: cshou vip. sina. com 基础实验诊断研究 六种支原体单克隆抗体的制备与鉴定 杨文君* 张建芝* 李燕 张艳丽 寿成超 【摘要】 目的 制备针对临床常见的六种支原体的特异性单克隆抗体, 为临床支原体感染检测 提供工具。方法 用灭活的支原体颗粒免疫 BA
2、LB/ c 小鼠, 通过传统杂交瘤技术制备抗支原体单克 隆抗体, 采用 6 种支原体蛋白以酶联免疫吸附试验 (ELISA) 进行交叉筛选, 并用免疫印记法 (WB) 对 其特异性进行鉴定。结果 获得针对生殖支原体、 梨形支原体、 猪鼻支原体、 发酵支原体、 肺炎支原 体、 穿透支原体的特异性单克隆抗体各 1 株, 经 ELISA 检测证实具有较好的反应特异性, 其中, 单抗 Mg 6H1、 Mpri ZW1 和 Mpe 6G4 在 WB 中也同时分别与生殖支原体、 梨形支原体和穿透支原体呈特异 反应。结论 获得针对 6 种人体常见感染支原体的不同单克隆抗体, 它们在 ELISA 检测中具较好的
3、 反应特异性, 有望应用于支原体感染检测。 【关键词】 支原体属; 抗体, 单克隆; 酶联免疫吸附测定 Production and identification of monoclonal antibodies against six different Mycoplasmas YANG Wen-jun*, ZHANG Jian-zhi*, LI Yan,ZHANG Yan-li, SHOU Cheng-chao. * Beijing Institute for Cancer Research,Peking University School of Oncology,Beijing 1000
4、34,China Corresponding author: SHOU Cheng-chao, Email:cshou vip. sina. com 【Abstract】 Objective To prepare specific monoclonal antibodies( MAbs) against different Mycoplasmas forclinicaldiagnosticsandrelatedresearch. Methods MAbsagainstsixdifferent Mycoplasmas were prepared by hybridoma technique. T
5、o eliminate cross-reactions among the Mycoplasmas, six Mycoplasmas were used for screening by enzyme-linked immunosorbant assay ( ELISA).The characterization of the six MAbs was further performed by ELISA and Western blot analysis. Results Six MAbs,designated Mg6 H1,Mpir ZW1,Mp 3D11,Mhy 2G10,Mpe 6G4
6、,M f2D6 were achieved. ELISA analysis showed six MAbs had high affinity and specificity to the related Mycoplasma. Conclusion We obtained six specific and stable MAbs against six different Mycoplasmas,which might be used in the clinical detection and treatment of mycoplasma infection. 【Key words】 My
7、coplasma; Antibody, monoclonal; Enzyme-linked immunosorbant assay 支原体能在无生命培养基中生长和繁殖的最 小原核细胞型微生物,属于柔膜体纲 (Mollicute) 。 近年研究发现, 肺炎支原体 (Mp) 可引发儿童原发性 非典型肺炎和其他呼吸道感染性疾病 (如支气管 炎、 咽炎) 及其他系统的严重并发症 1; 生殖支原体 (Mg) 与非淋菌性尿道炎、 子宫颈炎、 子宫内膜炎相 关 2; 发酵支原体 (Mf) 可引起致死性暴发性多器官 感染, 其也是引起呼吸道和关节疾病的重要潜在致 病因素 3, 4; 而生殖支原体、 发酵支原体
8、、 穿透支原 体 (Mpe) 、 梨形支原体 (Mpir) 则被认为是艾滋病 (AIDS) 的潜在协同因素 5-8。20 世纪 60 年代, 有 人发现支原体感染的细胞株出现染色体畸变, 细胞 形态改变和转化现象 9, 10, 推断支原体感染与肿瘤 发生可能存在一定相关性。我们最近通过免疫组化 等方法发现肿瘤组织中有较高支原体感染率, 并首 次通过分离培养发现胃癌组织中存在猪鼻支原体, 提示支原体感染与肿瘤发生存在潜在的相关 性 11-14。由于支原体感染与人类多种疾病密切相 关, 但目前商品化的特异性支原体抗体种类又非常 有限, 难以满足临床与科研的需要, 为此, 我们制备 了与人类疾病关系
9、较密切的 6 种支原体的单克隆抗 体, 并对其特异性进行鉴定, 为进一步临床应用及相 关研究提供工具。 651中华检验医学杂志 2006 年 2 月第 29 卷第 2 期 Chin J Lab Med, February 2006,Vol 29,No. 2 材料和方法 1. 支原体菌种: 生殖支原体 (G37 株, ATCC 33530) 、 梨支原体 (HRC70-159 株, ATCC 25960) 、 穿 透支原体 (GTU-54 株, ATCC 55252) 、 发酵支原体 (incognitus 株) 、 肺炎支原体 (ATCC 1553) 和猪鼻支 原体 (ATCC 17981)
10、, 分别由首都儿科研究所郭章溉 研究员和东南大学赵季文教授惠赠。 2. 支原体培养和抗原制备: 所有支原体皆在传 统 Hayflick 液体培养基中培养。每 100 ml 培养基 含 7 份 PPLO 基础培养液 (Mich) , 2 份无菌灭活兔 血清, 1 份 25% 新鲜酵母浸液, 同时含 50% 葡萄糖 2 ml、 0. 4% 酚红 0. 6 ml、 1 mol/ L NaOH 0. 4 ml 和 20 万 U/ ml青霉素 0. 5 ml, 将上述成分混匀后调 pH 7. 8, 支原体在 Hayflick 液体培养基37培养, 至 培养液颜色由红色转向黄色后, 取少量进行颜色变 化单
11、位 (CCU) 定量, 其余 50 水浴灭活 30 min, 1 500 r/ min 离心 30 min 去除不溶性颗粒, 上清液 20 840 r/ min 离心30 min, 其沉淀物用 PBS (pH 7. 4) 缓 冲液洗 2 次, 沉淀物用 PBS 悬浮, 其体积为原培养 液的 1/100, -70 保存备用。 3. 支原体蛋白的获得和定量: 将含支原体的 PBS 悬浮液进行超声处理, 18 KHz 10 s, 停 10 s, 反 复 4 6 次至菌液清亮, 按 BCA 蛋白定量试剂盒 (PIERCE 公司) 操作说明书进行定量。 4. 单克隆抗体制备: 分别取 6 种支原体悬浮液
12、 皮下多点注射免疫 6 8 周龄 BALB/ c 小鼠 (中国医 科院实验动物研究所) 各 5 只。基础免疫 3 4 次, 间隔 3 周, 每只每次 5 108CCU 支原体抗原, 初次 免疫, 与等体积完全福氏佐剂乳化, 其余 2 3 次加 不完全福氏佐剂, 末次免疫后 7 10 d, 用酶联免疫 吸附法 (ELISA) 检测血清效价, 取效价高于 10 -4的 小鼠进行融合。融合前用不含佐剂的支原体蛋白抗 原 (30 g) 进行眼静脉注射免疫, 3 d 后取脾脏采用 传统杂交瘤技术与小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0 细胞融 合, 经次黄嘌呤、 氨基喋呤与胸苷 (HAT) 选择性培 养, 第一次亚
13、克隆后改为半量 HAT 培养基, 第二次 亚克隆后改为 HT 培养基。用 ELISA 筛选阳性克 隆, 采用有限稀释法进行亚克隆, 3 轮后获得全部阳 性单克隆。单克隆抗体亚类的鉴定, 按小鼠单抗亚 型鉴定试剂盒 (Sigma 公司) 说明书操作。将杂交瘤 细胞 1 106接种小鼠腹腔, 收集腹水, 用 ProteinA- Sepharose4B 纯化抗体。 5. ELISA 鉴定单克隆抗体特异性: 不同支原体 经超声和蛋白定量后, 用碳酸缓冲液 (pH9. 3) 稀释 至 60 g/ ml 后包被 96 孔酶标板 (50 l/ 孔) , 4过 夜, 次日弃包被液, PBS 洗 3 遍, 5%
14、 脱脂奶粉 (PBS 配制) 封闭, 室温 2 h, 分别在 6 种支原体蛋白包被 的抗原板中加 5、 2. 5、 1. 25、 0. 625 g/ ml 的抗体, 室 温反应 1 h, 加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗 体, 并用底物邻苯二胺显色, 用酶标仪在 492 nm 处 测吸光度。 6. 免疫印迹法 (WB) 鉴定单克隆抗体特异性: 取等量各支原体总蛋白, 加等体积 2 上样缓冲液, 迅速煮沸变性 5 min, 10 000 r/ min 离心 10 s 后上 样, 行 10% 十二烷基磺钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 至溴芬蓝达底端, 电转移至硝酸纤维 素膜上, 5%脱
15、脂奶 (PBS 配制) 4 封闭过夜, 次日 加各支原体单抗 (5 g / ml) , 室温放置 1 h 后, 0. 05%吐温 20/ PBS 洗 5 次, 加羊抗鼠-HRP IgG (1 : 1 000) , 室温 45 min, 充分洗后进行 WB 检测。 结果 1. 支原体单克隆抗体的筛选结果: 用灭活的支 原体颗粒作抗原进行小鼠免疫及细胞融合, 通过对 不同支原体总蛋白进行 ELISA 交叉筛选, 分别获得 生殖支原体单抗 Mg 6H11、 梨形支原体单抗 Mpri ZW1、 猪鼻支原体单抗 Mhy 2G10, 穿透支原体单抗 Mpe 6G4、 肺炎支原体单抗 Mp 3D11 及发酵
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