养阴药物血清对内毒素诱导血管内皮细胞凋亡的影响.pdf
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1、第2 3 卷第1 期 2 005年 1月 B E药学刊 OF T R A DIT I O N A L C H IN E S E V o l . 2 3 N o . 1 J a n. , 20 05 文章编号: 1 0 0 9 一 5 2 7 6 ( 2 0 0 5 ) 0 1 一 0 0 4 1 一 0 2 养阴药物血清对内毒素诱导血管内皮细胞凋亡的影响 朱平, 龚婕宁, 许冬青, 杨进 ( 南京中医 药大学, 江苏 南京 2 1 0 0 2 9 ) 摘要: 目 的: 研究养阴药物血清对内毒素诱导的血管内皮细胞凋亡的影响。方法: 用低浓度 US诱导 E C V 3 o 4 凋 亡, 用中药 血
2、清与 之作用, 米用 流式细 胞仅检浏细胞凋 亡。结果: 养阴药 物血清可以明显抑制血管内 皮的凋 亡。同模型组比较有统计学意义。结论: 养阴药物血清可明显拮杭内毒素诱导的血管内皮细胞的凋亡。 关键词: 血清药理学; 内 毒素; E C V 3 o 4 ; 细胞凋 亡 中图分类号: R一 3 3文献标识码: A 血管内皮细胞是血管壁和血液之间的分界细胞。近 年来研究发现: 血管内皮细胞的凋亡和血管病变的发生 有密切的关系。 研究表明: 动脉粥样硬化( a t h e r o s c l e r o s i s , A S ) 是动脉 壁对各种损害的炎症一增殖性反应。血管内皮细胞 ( v a s
3、 c u l a r e n d o t h e li a l c e ll , V E C ) 激活是血管炎症的始动阶 段, 在A S 发病中可能起着重要作用。大肠杆菌内毒素 ( L P S ) 是经典的炎症刺激物, 能导致 V E C的损伤, 此种 损伤以细胞凋亡的形式出现 i l 。用L P S 来诱导血管内 皮细胞的凋亡, 同时用中药血清与之作用, 运用流式细胞 术来观察细胞的凋亡, 以探讨养阴药物及其不同配伍治 疗血栓性疾病的作用机理。 1 含药血清的制备 1 . 1 药物及组方 药物购自 南京市药材公司, 经本校中 药鉴定教研室鉴定为正品, 符合实验要求。 药物按照以下方案组方,
4、养阴方: 生地 1 2 g , 玄参 1 5 g , 麦冬1 2 g 。 养阴活血方: 上方加丹参1 2 g ; 养阴益气 方: 养阴方加生晒参1 2 g ; 全方: 养阴方加丹参1 2 g , 生晒 参 1 2 g . 以上药物依照常法煎煮, 在 6 0 恒温条件下, 浓缩 成每毫升药液含生药l g 的浓缩液, 以0 . 1 M P a 的压力, 高温灭菌后, 置于4 冰箱备用。 1 . 2 动物 S D大鼠, 雌雄不拘, 体重( 2 5 0 1 2 0 ) g ( 南京 中医药大学动物实验中心提供) , 动物许可证号二 S C X K ( 苏) 2 0 0 2 一 0 0 1 2 。一、
5、1 . 3 动物 血清的 制备 5 ( 即人每日临床用量x 按 界 人 每 日 鳞用 最 0 .0 18 x . 动物蜂效面积系数 x 恤清稀释 中医药 度) 的 标 准 浓 度给 大鼠 灌胃 ( 清 热 解 毒 组8 . 8 9 7 zn L / K g 分 2 次进行) 。连续灌胃3 夭, 正常对照组灌温开水。于末 次灌胃 后1 h 后( 灌药前禁食不禁水 1 2 h ) 无菌条件下顶 动脉取血, 1 7 0 0 以 m i n , 1 5 m i n 离心分离血清, 然后 5 6 U 3 0 m i n 水浴灭活, 在超净台上用0 . 4 5 p M的微孔滤膜过 滤除菌, 置于一 2 0
6、 冰箱保存。 4 1 学刊 收稿8期: 2 0 0 4 一 0 6 一 2 3 基金项目: 国家自 然科学基金资助项目 ( 3 0 2 7 1 5 7 7 ) 作者筒介: 朱平( 1 9 7 6 一 ) , 男, 陕西汉中人, 2 0 0 2 级博士研究生, 主要从事温病治法机理方面的研究。 2 实验材料 试剂及仅琴 人脐静脉血管内皮细胞( E C V 3 0 4 . 购自 中国 科学院典型培养物保藏委员会) , R P M I 一 1 6 4 0 培养 基( G I B C O , U S A ) , 胰蛋白酶( T y p r i n , 1 : 2 5 0 , A m e r s o ,
7、 U S A ) , 小牛血清( 杭州四季青) , 6 孔细胞培养板( C o s t a r , D e n m a r k ) , 5 % C q 培养箱( N A P C O , U S A ) , 倒置相差显 微 镜( O l y m p u s , J a p a n ) , 大肠杆菌内毒素( L P S , 0 1 2 7 B s , S ig m a , U S A , L o t : 2 8 1 1 4 0 4 2 ) , 无水乙 醇( 分析纯, 上海振兴 化学试剂厂, 批号: 2 0 0 2 1 2 0 0 3 6 5 ) , P I ( S ig m a 产品) , 流式
8、细胞仪( F A C S C a l ib u r , B D , U S A ) . 3 实验方法 3 . 1 造模方法 将生长良 好的E C V 3,用0 . 2 5 % 的 胰蛋 白酶消化, 轻轻吹打, 制成细胞悬液, 调整细胞浓度为5 x 1 0 6 / m L , 接种于6 孔板中。待细胞长满后( 约2 4 h ) , 弃 去上清液。 将呈对数生长期的血管内皮细胞分为8 组, 即: ( 1 ) 正常组, 加含巧%小牛血清的培养基; ( 2 ) 正常鼠血清 组, 加含 1 5 %正常大鼠血清的培养基; ( 3 ) 模型A组, 加 L P S ( 终浓度为5 K g / m L , 下同
9、) 、 含1 5 % 小牛血清的培养 基; ( 4 ) 模型B 组, L P S 、 含 1 5 %正常大鼠血清的培养基; ( 5 ) 养阴组, L P S 、 含1 5 %养阴药物血清的培养基; ( 6 ) 养 阴活血组, L P S 、 含1 5 %养阴活血药物血清的培养基; ( 7 ) 养阴益气组, L P S 、 含 1 5 %养阴益气药物血清的培养基; ( 8 ) 全 方 组 , L P S 、 含1 5 % 全 方 药 物 血 清 的 培 养 基; 每 组3 孔。 操 作完 成后, 置于3 7 r- , 5 % -C 0 2 饱 和湿度的培养箱 中 培养2 4 4h , 每隔6 h
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