力学应变对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化能力的影响.pdf
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1、力学应变对大鼠骨髓间充质干细胞增殖 和成骨分化能力的影响* 井燕1李良1 李毅1陈孟诗2吴文超1陈槐卿1刘小菁3 1 (四川大学 华西基础医学与法医学院 生物医学工程研究室,成都6 1 0 0 4 1 ) 2 (四川大学 建筑与环境学院,成都6 1 0 0 6 5 ) 3 (四川大学 华西医院 心血管疾病研究室,成都6 1 0 0 4 1 ) 摘要探讨周期性双轴力学应变对大鼠骨髓间充质干细胞( Me s e n c h y ma l s t e m c e l l s , MS C s )增殖和成骨分化 能力的影响。选用9月龄健康S D雌性大鼠,分离股骨、胫骨提取骨髓,采用密度梯度离心法分离M
2、S C s 。体外培养 MS C s传至第3代,以1 1 0 5细胞浓度接种于双轴力学应变系统, 选取40 0 0 s t r a i n ,频率为1 h z的力学应变对 MS C s加载。每天加载3次, 每次2h ,间隔2h 。观察力学应变作用后1d 、 3d , MS C s增殖和成骨分化能力的变化, 并 与相应未加力学应变对照组比较。结果表明:( 1 )力学应变可增高MS C s的碱性磷酸酶( AL P )和骨桥蛋白 ( OP N)表达量;力学应变作用3d后MS C s的AL P和OP N表达量明显高于力学应变作用1d 。 I型胶原( C OLI )仅 在力学应变作用3d增高;骨钙素(
3、OC N)在各组无明显变化。( 2 )力学应变可促进MS C s增殖,但力学应变作用1d 和3d对MS C s增殖的作用无明显差异。上述结果提示:力学应变可以促进MS C s的增殖和成骨分化能力。 关键词力学应变骨髓间充质干细胞成骨分化 T h eE f f e c t o f Me c h a n i c a l S t r a i no nP r o l i f e r a t i o na n dO s t e o g e n i c D i f f e r e n t i a t i o no f B o n eMa r r o wMe s e n c h y ma l S t e m
4、 C e l l s f r o m R a t s J i n gY a n 1 L i L i a n g 1 L i Y i 1 C h e nme n g s h i 2 Wuw e n c h a o 1 C h e nh u a i q i n g 1 L i uX i a o j i n g 3 1 ( I n s t i t u t e o fB i o me d i c a l E n g i n e e r i n g , B a s i c Me d i c i n e a n dF o r e n s i c Me d i c i n e C o l l e g e ,
5、 S i c h u a nUn i v e r s i t y , C h e n g d u 6 1 0 0 4 1 , C h i n a ) 2 ( C o l l e g e o fAr c h i t e c t u r e a n dE n v i o n me n t , S i c h u a nUn i v e r s i t y , C h e n g d u 6 1 0 0 6 5 , C h i n a ) 3 ( L a b o r a t o ro fC a r d i o v a s c u l a rDi s e a s e s ,We s t C h i n
6、 aHo s p i t a l ,S i c h u a nUn i v e r s i t y ,C h e n g d u 6 1 0 0 4 1 , C h i n a ) A b s t r a c t I no r d e rt oi n v e s t i g a t et h ee f f e c t so f c y c l i cb i a x i a l me c h a n i c a l s t r a i no np r o l i f e r a t i o na n do s t e o g e n i c d i f f e r e n t i a t i o
7、 no fb o n ema r r o w me s e n c h y ma l s t e m c e l l s( MS C s ) f r o m r a t s .T h eMS C swe r ei s o l a t e df r o m b o n e ma r r o wi nt h e9 - mo n t h - o l df e ma l eS p r a g u e - D a wl e yr a t s b yad e n s i t yg r a d i e n t me t h o d .Af t e r t h et h i r dp a s s a g e
8、, 1 1 0 5c e l l swe r es e e d e do nt h ef l e x i b l es i l i c o n eme mb r a n ei nt h ec y c l i cb i a x i a l me c h a n i c a l s t r a i nu n i t .T h ea mp l i t u d e o fme c h a n i c a l s t r a i na p p l i e dt ot h ec e l l swe r e40 0 0 s t r a i n ,a taf r e q u e n c yo fo n eh
9、e r t z ( 1 Hz ) ,f o rp e r i o d so f3 r e p e t i t i o n so f2h o u r s me c h a n i c a ls t r a i na n dab r e a ko f2h o u r s .T h eo s t e o b l a s t i cma r k e rs u c ha so s t e o p o n t i n ( OP N) , a l k a l i n ep h o s p h a t e a s e ( AL P ) , o s t e o c a l c i n ( OC N) , t y
10、 p eIc o l l a g e n ( C o l I )we r ed e t e c t e db yR T- P C R .T h e p r o l i f e r a t i o no f a l l c e l l swe r es t u d i e dwi t hF l o wC y t o me t r y ( F C M) .AL Pa n dOP Nl e v e l ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e di n t h eme c h a n i c a l s t r a i n e dg r o u p s a
11、n dr e a c h e dt h e t o pa t 3 t hd a ya f t e r me c h a n i c a l s t r a i n .C OLI l e v e l wa s i n c r e a s e o n l y a t 3 t hd a ya f t e rme c h a n i c a l s t r a i n ,a n dt h ec h a n g eo f OC Nwa sn o t o b v i o u si ne v e r yg r o u p .T h ep r o l i f e r a t i o ni n d e x o
12、f t h eme d c h a n i c a l s t r a i n e dg r o u p s wa s i n c r e a s e d , c o mp a r e dwi t ht h ec o n t r o l . T h e s er e s u l t s s h o we dt h a t me c h a n i c a l s t r a i nc a ni mp r o v eMS C sp r o l i f e r a t i o na n dma k eMS C sd i f f e r e n t i a t et oo s t e o b l a
13、 s t . Ke y w o r d sMe c h a n i c a ls t r a i nB o n e ma r r o w me s e n c h y ma ls t e m c e l l s( MS C s )Os t e o g e n i c d i f f e r e n t i a t i o n *国家自然科学基金资助项目( 3 0 2 7 0 3 5 9 ; 3 9 8 7 0 2 0 1 ) 通讯作者。E - ma i l :l i l i a n g wc u ms . e d u . c n 生物医学工程学杂志 JB i o me dE n g = = =
14、 = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = 2 0 0 6 ; 2 3 ( 3 ) :5 4 2 5 4 5 1 前言 骨 髓 间 充 质 干 细 胞( B o n ema r r o w me s e n c h - y ma l s t e m c e l l s , MS C s )是一种多分化潜能干细胞, 具有自我复制和多向分化能力,将这种干细胞施以 合适的诱导物,便可向一定目的
15、细胞分化。在体外经 不同的诱导剂可诱导分化成不同的组织和细胞,如: 在胰岛素,地塞米松,吲哚米沙星,异丁基甲基黄嘌 呤存在下可以向脂肪细胞分化;在表皮生长因子或 脑源性神经营养因子作用下可诱导分化为神经细 胞;在地塞米松,维生素C , -甘油磷酸酯共同作用 下可转化为成骨细胞 1 。除了化学因素外,物理因素 也可以促使其向成骨细胞转化,如脉冲电磁场等 2 。 但是有关力学应变对MS C s的影响研究较少,本研 究的目的就是观察力学应变对MS C s成骨分化能力 和增殖的影响,以期为MS C s向成骨细胞转化提供 新的思路。 2 材料与方法 2 . 1 实验动物和材料 健康未生育9月龄雌性S p
16、 r a g u e - D a wl e y ( S D) 大鼠2 4只,由四川省医学科学院实验动物研究所提 供。D ME M(低糖, L G)培养基( G I B C O) ,胎牛血清 ( F B S , G I B C O) ,淋巴细胞分离液(生化试剂,上海试 剂二厂) , P B S缓冲液,胰蛋白酶( G I B C O) ,碘化丙 啶( P I , S i g ma ) ,二乙基焦磷酸胺( D E P C , S i g ma ) , d NT P 、R T- P C R 试 剂 盒、T a q D NA合 成 酶 ( F e r me n t a s公司) , 引物的设计和合成由宝
17、生物工 程(大连)有限公司完成, C O2细胞孵箱( He r a e u s ) , 流式细胞仪( E L I T A E S P , C o u l t e r ,美国) , R T- P C R 仪( E p p e n d o r f公司,美国) 。 2 . 2 方法 2 . 2 . 1 骨髓间充质干细胞的体外培养采用密度 梯度离心法分离大鼠骨髓间充质干细胞 3 。在无菌 条件下分离大鼠的股骨,胫骨,去除软组织和骨膜, 切除两端骨骺。用针筒吸取5ml D ME M培养液冲 出骨髓,吹散细胞, 20 0 0r p m/ mi n ,离心1 0mi n ,弃 上清后加入3ml D ME M
18、培养液制成骨髓细胞悬 液,贴壁缓慢加入装有等体积淋巴细胞分离液的离 心管中, 20 0 0r p m/ mi n ,离心3 0mi n ;小心吸取分 离液和细胞悬液界面层细胞,用D ME M培养液洗2 次,收集细胞,血细胞计数板计数,以4 1 0 6/ ml 的 密度接种于培养瓶,加入含1 0 %F B S ,青霉素1 0 0 U/ ml ,链 霉 素1 0 0 g / ml , 2 5mmo l / L HE P E S的 D ME M培养液4 ml , 放入3 7 , 5 %C O2孵箱中,第 5 d首次换液, 弃悬浮细胞。以后每3 4 d换液一次, 直至细胞长成融合状态进行细胞传代。取3
19、 4代细 胞用于实验。 2 . 2 . 2 力学实验分组用0 . 2 5 %胰蛋白酶消化长 成融合状态的骨髓间充质干细胞,以1 1 0 5个细胞 接种于已处理的双轴力学应变培养小室,加入含 1 0 % F B S的D ME M培养液。次日细胞长成亚融合 状态,吸取原液与未贴壁细胞,定量加入含1 0 %F B S 的D ME M培养液3ml 。选取40 0 0 s t r a i n对细胞 加载。每天加载3次,每次2h ,间隔2h 。力学实验 分为: ( 1 )加力1d组( s t r a i n e d - 1 ) :按上述方法加力 1d ; ( 2 )对照1d组( u n s t r a i
20、 n e d - 1 ) :不加力学刺激, 与( 1 )培养相同时间; ( 3 )加力3d组( s t r a i n e d - 3 ) : 按上 述 方 法 施 加 力 学 刺 激 3d ; ( 4 )对 照3d组 ( u n s t r a i n e d - 3 ) :不加力学刺激,与( 3 )培养相同时 间。 2 . 2 . 3 细胞周期分布与细胞增殖检测力学应变 实验结束后,培养小室中的骨髓间充质干细胞用 P B S清洗2次, 用0 . 2 5 %胰蛋白酶消化细胞, 10 0 0 r / mi n离心5mi n , 去上清,加入碘化丙锭( 5 0mg / L ) ,室温下避光反应2
21、 0mi n ,经流式细胞仪检测和 细胞周期分析软件拟合处理,分析细胞周期变化与 增殖活性。用增殖指数( P r o l i f e r a t i o ni n d e x , P I ; P I = S +G2/ M期细胞百分比) 表示细胞的增殖活性。 2 . 2 . 4 骨桥蛋白( Os t e o p o n t i n , OP N) ,碱性磷酸酶 ( Al k a l i n ep h o s p h a t a s e , AL P ) ,骨 钙 素( Os t e o c a l - c i n , OC N) , 型 胶 原( T y p e c o l l a g e n
22、, C o l) mR NA的测定 力学应变实验结束后,培养小室中 的骨髓间充质干细胞用含0 . 1 % D E P C的 P B S冲 洗2遍,用T r i z o l提取总的R NA,取细胞总R NA 2 u l ,加入0 . 1 % D E P C水9 8u l ,分别于紫外分光光度 计2 6 0n m和2 8 0n m处读取 A值, A2 6 0/ A2 8 0值为 1 . 8 2 . 0间方可使用。按R T- P C R试剂盒说明操 作,进行逆转录和P C R扩增反应。引物序列如下: OP N:上游5 - G C AT T AC AG C AAAC AC T C - 3 ;下 游 5
23、 - C C AAG C T AT C AC C T C G G A- 3 ,产 物 长 度 3 5 3 b p 。 AL P :上游5 - C T AC T T G T G T G G C G T G AA G G- 3 ;下 游5 - AAT G C T G AT G AG G T C C AG G- 3 ,产物长度是4 1 8b p 。OC N:上游5 - G AG G AC C C T C T C T C T G- 3 ;下 游5 - AG G T AG C G C C G G AG T C - 3 ,产物长度4 0 0b p ; C o lI :上游5 - C C C AC C C
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