内皮素的mRNA在实验性牙髓炎组织中的表达.pdf
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1、内皮素的 mRNA 在实验性牙髓炎组织中的表达 刘英群1*,彭旭霞2,王锐1 (1. 哈尔滨医科大学口腔医学院 儿童口腔科,黑龙江 哈尔滨 150001; 2. 哈尔滨医科大学第二临床医学院 儿童口腔科,黑龙江 哈尔滨 150086) 摘要 目的通过检测内皮素-1 (ET-1) 在牙髓组织中的表达, 探讨 ET-1 与正常及炎性牙髓组织的关系。方法 以改良的单纯穿髓开放法建立 Wistar 大鼠实验性牙髓炎的动物模型, 病理观察分析该型的牙髓组织情况; Northern 杂交分析牙髓组织内 ET-1 的 mRNA 表达水平。结果ET-1mRNA 在正常组及牙髓炎组均有表达, 且在炎症时增长 明
2、显, 以牙髓炎 3 天组表达量最多。结论ET-1 参与了牙髓炎症的发生与发展过程。 关键词 内皮素; 牙髓组织; 牙髓炎; Northern 杂交 中图分类号R- 332; R781.31文献标识码A 文章编号1000 - 1905 (2005) 03 - 0236 - 04 Expression of endothelin-1 mRNA in the experimental pulpitis models LIU Ying-qun, PENG Xu-xia, WANG Rui (Department of Pediatric Dentistry, School of Stomatology
3、, Harbin Medical University, Harbin 150001, China) Abstract:ObjectiveTo study the relationship between the expression of ET-1 mRNA and pulpal tissue in- flammation.MethodsThe experimental pulpitis models of rat were induced through simply pulp exposure by drilling maxillary molar with cool water.Pul
4、pitis were observed pathologically; The expression of ET-1 mRNA in pulp were analyzed by Northern hybridization.ResultsET-1 expression was observed in normal and inflamma- tory pulp and was up-regulated with its dominance at day 3.ConclusionET-1 may be involved in the occur- rence and development of
5、 pulpitis. Key words:endothelin; pulp; pulpitis; Northern hybridization 收稿日期2005 - 03 - 28 基金项目黑龙江省科技攻关项目资助 (GC02C149-02) 作者简介刘英群 (1961 - ) , 女, 黑龙江尚志人, 教授, 硕士研究生 导师。*通讯作者 内皮素 (endothelin, ET) 是一种血管活性肽, 是目 前所知血管收缩作用最强的物质, 具有广泛的生物 学效应, 对全身血压、 局部血流灌注及细胞增殖等有 重要作用 1。在人牙齿组织中, 血管内皮细胞是 ET 产生的唯一来源, 推测由内皮细胞产
6、生和释放的 ET, 可能通过旁分泌机制参与了正常和病理状态 下, 人牙髓组织的血压和血流的调节 2。牙髓微循 环是牙髓炎的首发部位, 其稳定性的调控直接影响 炎症的发生与发展 3。在牙髓微血管中 ET-1 受体 的存在, 可调控牙髓的微循环, 尤其在牙髓受损时更 为明显。牙髓微血管内皮细胞在局部炎症反应的地 方合成释放 ET, 引起组织修复或坏死 4。ET 的升 高可能是牙髓炎的病因, 也可能是牙髓炎的结果。 本研究通过检测 ET-1 在牙髓组织中的表达, 探讨 ET-1 与正常及炎性牙髓组织的关系, 为牙髓炎的早 期控制提供依据。 1材料与方法 1.1材料 ET-1 引物: 上游: 5-TC
7、TTCTCTCTGCTGTTTGTGGCTT-3 下游: 5-TCTTTTACGCCTTTCTGCATGGTA-3 TRIZOL 试 剂 (GIBCO) ; Image Master VDS-CL; Northern 杂交试剂盒; RT-PCR 试剂盒。 1.2大鼠实验性牙髓炎模型的建立 6 只 Wistar 大鼠, 随机分成 3 组, 每组 2 只, 改良 单纯穿髓开放法 5, 于上颌第 1、 2 磨牙开髓, 建立牙 髓炎模型, 第 3 磨牙不做任何处置作为对照组。分 别于 1 天、 3 天、 6 天处死大鼠, 取出牙齿, 固定、 脱 钙、 石蜡包埋、 切片 (5m) 、 HE 染色, 光镜
8、下观察。 1.3ET-1mRNA 的表达 1.3.1标本的制备: 32 只 Wistar 大鼠, 随机分成正 632 第 39 卷第 3 期 2005 年 6 月 哈尔滨医科大学学报 JOURNAL OF HARBIN MEDICAL UNIVERSITY Vol.39, No.3 Jun., 2005 常对照组、 牙髓炎 1 天组、 3 天组和 6 天组, 每组 5 只, 按上述方法建立牙髓炎模型, 分别于当天、 1 天、 3 天、 6 天处死大鼠, 即刻取出牙齿, DEPC 水擦拭牙 面, 暂放在液氮中, 于 - 70冰箱中保存备用。 1.3.2探针的制备 1.3. 2. 1RNA 的提取
9、: 100mg 组织加 TRIzol 试剂 1ml, 加入液氮中匀浆组织至粉末状, 混匀振荡, 加 TRIzol 试剂的 20%的氯仿, 进行相分离。15 30 孵育样品 5min,4, 12 000 g 离心 15min, 取无色 上层水相放入另一离心管中, 加 TRIzol 试剂的 50% 的丙醇。15 30孵育 10min, 4, 12 000 g 离心 10min。去除上清, 用 75%酒精洗涤 RNA 沉淀物, 加 与 TRIzol 试剂等量的 75%酒精, 4,7 500 g 离心 5min。短暂干燥 RNA, 沉淀 5 10min, DEPC 水溶解 RNA, 电泳, 拍照, 紫
10、外分光光度计测量 OD260/OD280 的比值, 测定其浓度, 储存 - 70冰箱中。 1.3.2.2RT-PCR: RT-PCR 反应条件为总 RNA5 l, Oligo (dT)1l, 加 DEPC 水 至 10. 5l, 70 变 性 10min, 冰浴 5min, 后加 MgCl24l、 10 buffer 2 l、 dNTP 2l, 总反应体积 20l, 50 1h、 94 10min; 从 总反应体积中取 5l, 加 10 buffer 2.5l、 MgCl21.5 l、 上下游引物各 0.5l、 Taq 酶 0.5l, 建立 25l 反应 体系, 94 变性 5min, 后 9
11、4 30s、 55 30s、 72 1min进行 30 个循环, 72延伸 10min。点样于 1% 的琼脂糖凝胶中, 电泳, 拍照。 1.3.2.3DNA 的回收: 割胶, 透析袋电泳洗脱法。 取 1 l 点样。 1.3.2.4DNA 的转化: 将 PCR 产物连接到 pMD18-T 载体上, 转化至 JM109 的感受态细胞中, 在含有 X- gal、 IPTG、 Amp 的 LB 固体培养基中培养, 形成单菌 落, 挑白色菌, 液体培养, 克隆 PCR 产物。 1.3.2.5质粒的提取、 鉴定: 按试剂盒要求提取质 粒, EcoR和 Hind(Katara) 双酶切鉴定质粒。取 液体菌液
12、 200l, 测序。 1.3. 2. 6地高辛 (DIG) 标记探针: 纯化后的 DNA 1l、 上下游引物各 3l、 去离子水 34.5l, 94变性 10min, 冰浴 5min, 加 10 Ebuffer 5l、 DIG DNA 3 l、 Ex Taq 0.5l, 94 1min, 后 94 30s、 45 30s、 72 1min 进行 30 个循环, 72延伸 10min, 取 2l 与纯化 的 DNA 1l 一同电泳, 拍照, - 20保存。 1.3.3Northern 杂交 1.3.3.1总 RNA 的提取: 同上。 1.3. 3. 2RNA 的琼脂糖凝胶电泳: 每一样品取 50
13、g, 纯化后稀释到 5l, 加 15.8l 变性液, 65变性 10min, 冰浴 5min, 各加 2l 上样缓冲液, 混匀, 变性 胶电泳。 1.3.3.3Northern 转移: 割胶, 用毛细管转移法 6, 将 RNA 吸引至硝酸纤维素 (NC) 膜上, 转移液为 20 SSC。转移后, 将 NC 膜置于滤纸上, 室温干燥 1h, 紫外线下照射 4min 固定后, 用 6 SSC 洗膜, 再置于 滤纸上, 干燥。 1.3.3.4DNA 探针与膜上的 RNA 杂交: 将 NC 膜放 入杂交盒中, 50预杂交 1h。将已标记的探针煮沸 变性 10min, 冰浴 5min, 加入预杂交液中,
14、 50杂交 过夜。用洗液洗 5min 2 次, 室温, 振荡; 洗液 洗 15min 2 次, 68, 振荡; 缓冲液洗 1min, 室温; 缓冲液洗 30min, 室温, 振荡; 抗 DIG 抗体 2l + 20ml 缓冲液洗 30min, 室温, 振荡; 0.3% Tween20 洗 15min 2 次, 室温, 振荡; 缓冲液洗 5min, 室温, 振荡。 1.3.3.5检测: 取出 NC 膜, 用 CDP-StarTM300 l 滴 于膜上, 混匀 5min, 在 Image Master VDS-CL 上成像, 用计算机图像分析仪检测 mRNA 的相对含量。 2结果 2.1实验性牙髓
15、炎动物模型 正常对照组: 牙髓组织内有少量血管和大量散 在分布的成纤维细胞, 在牙髓与牙本质交界处的髓 腔侧有一层柱状排列的成牙本质细胞。牙髓炎 1 天 组: 穿髓孔下方牙髓组织内有大量炎细胞浸润, 成牙 本质细胞轻度紊乱, 血管内有少量红细胞, 炎症反应 区外围成纤维细胞增生。牙髓炎 3 天组: 炎症反应 区成牙本质细胞空泡变性, 排列紊乱, 牙髓血管增 多、 扩张, 其外围细胞主要是白细胞和纤维样细胞。 牙髓炎 6 天组: 残屑和有活力的牙髓间有一炎细胞 带, 成牙本质细胞液化、 坏死, 排列成网状, 其周围有 较多的脓细胞, 微脓肿形成, 牙髓血管管腔内有大量 红细胞。 2.2探针的制备
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