卡那霉素对三种小鼠耳毒性比较及对血管纹NAK2CL联合转运子1表达的影响.pdf
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1、基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (30371526) ; 湖北省自然科学基金资助项目 (2002AB127) 作者单位: 430030 武汉, 华中科技大学同济医学院附属同济医院耳鼻咽喉科 通讯作者: !汉启, Email: qi7chu163. com 实验研究 卡那霉素对三种小鼠耳毒性比较及对血管纹 Na-K-2Cl 联合转运子 1 表达的影响 熊浩 褚汉启 韩芳 吴振恭 张平 王春芳 崔永华 【摘要】 目的 建立小鼠氨基糖甙类抗生素 (aminoglycoside antibiotics,AmAn) 耳毒性模型, 探 讨在不同种小鼠中的 AmAn 耳毒易感性及其对耳蜗血管纹 Na-
2、K-2Cl 联合转运子-1 (Na-K-2Cl co- transporter-1,NKCC1) 表达的影响。方法 将 72 只 C57BL/6J、 CBA/ CaJ、 NKCC1 + / -小鼠各自随机分 为 A、 B、 C、 D 4 组。A 组: 卡那霉素组; B 组: 卡那霉素 +2, 3-二羟基苯甲酸组; C 组:2, 3-二羟基苯甲 酸组; D 组: 生理盐水组。各组连续用药 14 d。各组动物在用药前、 用药后第 14 天及用药后第 35 天 行脑干诱发电位 (auditory brainstem response,ABR) 检测听功能; 耳蜗琥珀酸脱氢酶组织化学染色观 察耳蜗形态
3、学变化; 免疫组化法观察血管纹 NKCC1 表达的变化。结果 A 组小鼠 ABR 阈值明显 提高 (P 0. 05) 。 二、 ABR 检测 C57BL/6J 小鼠在应用卡那霉素 2 周后与用药 44中华耳鼻咽喉头颈外科杂志 2006 年 1 月第 41 卷第 1 期 Chin J Otorhinolaryngol Head Neck Surg,January 2006,Vol 41,No. 1 前的平均 ABR 阈值之间差异即有统计学意义 (t =5. 715, P 0. 05) , 但停药 3 周后的 平均 ABR 阈值与用药前之间差异却存在统计学意 义 (t =6. 325, P 0.
4、05, 图 1) 。CBA/ CaJ 及 NKCC1 + / - 小 鼠各组用药前后平均 ABR 阈值变化情况与之相似 (图 2, 3) 。 应用相同总剂量卡那霉素前后, CBA/ CaJ 小鼠的平均 ABR 阈移最大, 与 C57BL/6J 及 NKCC1 + / - 小鼠之间差异有统计学意义 (P 0. 05) 。 三、 耳蜗琥珀酸脱氢酶组织化学染色 图 1 C57BL/6J 小鼠各组 (各 7 只) 出生后不同时间的 平均 ABR 阈值 图 2 CBA/ CaJ 小鼠各组 (各 7 只) 出生后不同时间的 平均 ABR 阈值 在 C 组及 D 组小鼠中, 耳蜗各回内毛细胞和外 毛细胞均排
5、列整齐, 自然缺失率极小 (图4) ; 在 A 组 小鼠中, 耳蜗顶回内毛细胞和外毛细胞尚保存完好, 而在耳蜗底回, 内毛细胞基本保留, 外毛细胞则完全 丧失 (图5) ; 在 B 组小鼠中, 底回处尚残留部分外毛 细胞, 损伤明显较 A 组减轻 (图 6) 。 四、 耳蜗血管纹 NKCC1 免疫组化染色 正常小鼠耳蜗血管纹 NKCC1 主要在边缘细胞 图 3 NKCC1 + / - 小鼠各组 (各 7 只) 出生后不同时间的 平均 ABR 阈值 表达, 镜下可见边缘细胞呈棕黄色 ( 图 7) 。在 C57BL/6J 小鼠各组中, A 组边缘细胞处 NKCC1 阳 性染色强度明显减弱 (图 8
6、) , 在 B 组中, NKCC1 阳 性染色强度亦较正常减弱, 但较 A 组增强 (图 9) 。 经图像分析显示: 血管纹 NKCC1 染色的灰度值在 A 组是 125. 84 8. 35; 在 B 组是 51. 95 7. 20; 在 C 组是 36. 86 7. 44; 在 D 组是 33. 07 6. 39。A 组 与其他 3 组之间差异均有统计学意义 (P 0. 05) 。 CBA/ CaJ 及 NKCC1 + / - 小鼠各组结 果与 C57BL/6J 小鼠类似。 讨论 豚鼠长期以来一直作为 AmAn 耳毒性研究的动 物模型, 究其原因主要是豚鼠耳蜗对 AmAn 的损害 有着典型的
7、病理反应, 听阈提高及毛细胞的缺失情 况与人类相似, 且通过解剖较为容易得到 1。随着 分子生物学技术的飞速发展, 作为转基因技术主要 应用载体的小鼠越来越多地被应用于听力研究, 因 此建立小鼠 AmAn 耳毒性模型对于研究 AmAn 耳毒 作用机制及其防治方法有着极其重要的价值。 已有 54中华耳鼻咽喉头颈外科杂志 2006 年 1 月第 41 卷第 1 期 Chin J Otorhinolaryngol Head Neck Surg,January 2006,Vol 41,No. 1 图 4 正常耳蜗基底膜铺片显示内毛细胞和外毛细胞均排列整齐。琥珀酸脱氢酶组织化学染色 400 图 5 应用
8、卡那霉素后耳蜗底回 内毛细胞保留完好而外毛细胞全部丧失。琥珀酸脱氢酶组织化学染色 400 图 6 联合应用卡那霉素和 2, 3-二羟基苯甲酸后小鼠耳蜗 底回外毛细胞部分保留。琥珀酸脱氢酶组织化学染色 400 图 7 正常小鼠耳蜗血管纹 NKCC1 阳性表达主要在边缘细胞。免疫组化 SABC 染色 400 图 8 应用卡那霉素后小鼠耳蜗血管纹 NKCC1 阳性染色强度明显减弱。免疫组化 SABC 染色 400 图9 联合应 用卡那霉素和 2, 3-二羟基苯甲酸后小鼠耳蜗血管纹 NKCC1 阳性染色强度较单独应用卡那霉素明显增强。免疫组化 SABC 染色 400 文献 2报道在出生后 10 20
9、d 期间是小鼠耳蜗对 AmAn 的易感时期, 故本实验应用卡那霉素来诱导 4 周龄成熟小鼠听力损害, 避开了未成熟耳蜗对 AmAn 易感的干扰。在皮下注射卡那霉素 700 mg/ kg每天 2 次, 连续 14 d 的方案作用下, A 组小鼠 ABR 阈值明显提高。而当停药3 周后, 小鼠 ABR 阈 值进一步提高, 说明卡那霉素对小鼠的听力造成了 不可逆的损害, 而且在停药后继续加重。基底膜铺 片耳蜗琥珀酸脱氢酶染色显示 A 组小鼠毛细胞耳 蜗琥珀酸脱氢酶变淡甚至消失, 以外毛细胞损伤为 主, 各回相比以底回基底膜受损严重, 外毛细胞全部 丧失。这些生理学及形态学的变化与 AmAn 在豚鼠
10、及人类中的耳毒效应是一致的 1。在对照组小鼠 未出现任何听力损害。研究结果表明应用卡那霉素 能建立可靠的小鼠 AmAn 耳毒性模型。值得一提的 是诱导小鼠耳毒效应的卡那霉素剂量要比在豚鼠中 大得多。在豚鼠, 卡那霉素 250 mg/ kg 肌注每天 1 次, 连续 23 日可以诱导严重的耳毒效应 3,而卡 那霉素1000 mg/ kg 肌注每天1 次, 连续21 d 对小鼠 听力无明显影响 4。不同种动物对药物的不同反 应可能与药物代谢动力学、 组织吸收、 药物的生物激 活作用 5以及动物对药物的特殊敏感性等有关。 在有卡那霉素应用的 A 组和 B 组小鼠体重增长明 显低于 C 组和 D 组小
11、鼠, 可能与卡那霉素的肾毒性 有关。 目前普遍认为活性氧物质的形成是 AmAn 耳毒 机制之一 6。研究表明 AmAn 通过与铁离子螯合 而形成的铁离子-AmAn 复合物是氧自由基生成的 强大催化剂 7。2, 3-二羟基苯甲酸是铁离子的鳌合 剂, 它在体内通过与 AmAn 的竞争来抑制铁离子- AmAn 复合物的形成, 从而减少氧自由基的大量生 成。在豚鼠实验中已证实 2, 3-二羟基苯甲酸能有 效抑制 AmAn 耳毒作用 3, 8。在本实验中, B 组小鼠 ABR 阈值变化明显小于 A 组, 外毛细胞的损害也明 显减轻。结果表明 2, 3-二羟基苯甲酸在小鼠同样 可以作为保护剂来拮抗 AmA
12、n 耳毒作用; 小鼠同样 可以作为合适的动物模型来进行防治 AmAn 耳毒性 的研究。有意义的是在 B 组小鼠中, 虽然在联合用 药期间 ABR 阈移不明显, 但在停药3 周后, ABR 阈 移却具有显著性意义, 这充分表明了 AmAn 耳毒的 慢性效应 6, 也提示我们即使是在 AmAn 应用结束 后仍有使用保护剂的必要性。 Na-K-2Cl 联合转运子 (NKCC) 是动物细胞中广 泛分布的一类膜转运蛋白, 其作用是将 Na + 、 K + 、 Cl - 按 1: 1: 2 的比例呈电中性跨膜转运。NKCC 共 有 2 个亚型。位于细胞基底侧, 具有分泌功能的 NKCC1 有着广泛的组织分
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