中国小型猪空肠弯曲菌的首次分离及其鉴定.pdf
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1、2 0 0 9 年1 1 月 第1 9 卷第1 1 期 中国比较医学杂志 C m N E S EJ O U R N A LO FC O M P A R A T I V EM E D I C I N E N o v e m b e r ,2 0 0 9 V 0 1 1 9N o 1 1 庐e g 婶) 9 | 研究报告$ :、e 镕、! 务、e ;e ;、妙 中国小型猪空肠弯曲菌的首次分离及其鉴定 高正琴1 ,贺争鸣1 ,张强2 ,岳秉飞1 ,邢进1 ( I 中国药品生物制品检定所。北京1 0 0 0 5 0 ) ( 2 首都医科大学附属北京佑安医院,北京1 0 0 0 6 9 ) 【摘要】目的
2、对中国小型猪空肠弯曲菌进行分离鉴定。方法采集发病小型猪标本,采用细菌学分离培 养、生化鉴定、药敏试验、血清学试验、P c R 检测等方法进行鉴定,并对细菌的分子生物学特征进行分析。结果分 离到l 株细菌,经鉴定为空肠弯曲菌( C J p 0 8 1 2 ) 。用空肠弯曲菌肋A 基因特异引物对C J p 0 8 1 2 细菌的P C R 扩增为 阳性,经核苷酸序列测定分析证实上述序列与空肠弯曲菌N C T C I l l 6 8 基因序列( G e n B a n k 登录号:N C 0 0 2 1 6 3 ) 同源性 高达9 9 。结论首次从中国小型猪中分离到了空肠弯曲菌,为进一步研究该菌及开
3、展流行病学调查提供了科学 依据。 【关键词】小型猪;空肠弯曲菌;分离;鉴定 【中图分类号】R - 3 3【文献标识码】A【文章编号】1 6 7 1 7 8 5 6 2 0 0 9 ) 1 1 - 0 0 4 7 0 4 T h eF i r s tI s o l a t i o na n dI d e n t i f i c a t i o no fC a m p y l o b a c t e rj e j u n i f r o mM i n i a t u r eP i g si nC h i n a G A OZ h e n g - q i n l ,H EZ h e n g - m
4、i n 9 1 ,Z H A N GQ i a ,Y U EB i n g - f o i ,X I N GJ i n l ( 1 N a t i o n a lI n s t i t u t e f o rt h eC o n t r o lo fP h a r m a c e u t i c a la n dB i o l o g i c a lP r o d u c t s ,B e i j i n g1 0 0 0 5 0 ,C h i n a ; 2 C a p i t a lU n i v e r s i t yo fM e d i c a lS c i e n c eA f f
5、i l i a t e dB e r i n gY o u a nH o s p i t a l ,B e i j i n g1 0 0 0 6 9 ,C h i n a ) 【A b s t r a c t 】O b j e c t i v e T oi s o l a t ea n di d e n t i f yC a m e f l o b a a e r j e j u n i nm i n i a t u r ep i gi nC h i n a M e t h o d s S p e c i m e n so fa d i s e a s e dG u i z h o um i
6、n i a t u r ep i gw e r ec o l l e c t e d B a c t e r i ai s o l a t i o na n dc u l t u r e ,b i o c h e m i c a li d e n t i f i c a t i o n ,s u s c e p t i b i l i t yt e s t ,8 e r u l l l a g g l u t i n a t i o nt e s t ,P C Ra s s a yw e r ec o n d u c t e d R e s u l t s O n es t r a i no
7、f C a m p y o b a c t e rj e j u n ( C J p 0 8 1 2 ) W 8 8i s o l a t e d a n d i d e n t i f i e d T h eg e n o m eo fC J p 0 8 1 2s t r a i nc o u l db ea m p l i f i e db yC a m p f l o b a a e rj e j m 加Ag e n e s - s p e c i f i cp r i m e ri nP C Ra s s a y T h r o u g hd e t e r m i n a t i o
8、 no ft h en u c l e o t i d es e q u e n c e ,t h eh i g h e s ts e q u e n c eh o m o l o g yo ft h i ss t r a i no fb a c t e r i ac o u l db ed e m o n s t r a t e d w i t hC a m p y l o b o c t e rj e j u n iN C T C l11 6 8 ( N C 0 0 2 1 6 3 ) a n di tW a sf o u n dt ob e9 9 C o n c l u s i o n
9、I t i sc o n c l u d e dt h a tt h es t r a i n C J p 0 8 1 2a p p e a r st ob eC a m p y o b a a e r 歹咖斑f i r s ti s o l a t e df r o mm i n i a t u r ep i gi nC h i n a ,a n di tp r o v i d e sr e l i a b l es c i e n c ed a t af o r f u r t h e rr e s e a r c ha n de p i d e m i o l o g i c a ii
10、n v e s t i g a t i o n 【K e yw o r d s 】M i n i a t u r ep i g ;C a m p y l o b a c t e r j e j u n i ;I s o l a t i o n ;I d e n t i f i c a t i o n 空肠弯曲菌( C a m p y l o b a c t e r j e j u n i ,C j e j u n i ) 是一 种重要的人畜共患病病原,是全球范围内急性胃肠 炎最常见的病因之一,可以通过带菌动物、鸟类以及 人类患者的粪便污染环境,通过饮用水、牛奶、禽肉 等传染给人类,从而引起流产
11、、死胎、菌血症、脑膜 炎、胆囊炎、心内膜炎、反应性关节炎、莱特尔综合 基金项目】北京市科委公益应用项目D 0 7 0 8 0 2 0 0 7 2 0 7 0 1 。 【作者简介】高正琴( 1 9 7 6 - ) ,女,助理研究员,硕士,研究方向:微生物学和免疫学。 通讯作者】贺争鸣( 1 9 5 7 - ) ,男,研究员,博士,研究方向:微生物学和免疫学。 万方数据 a , 8中国比较医学杂志2 0 0 9 年1 1 月第1 9 卷第1 1 期C h i nJC o m pM e d ,N o v e m b e r2 0 0 9 ,V 0 1 1 9 N o 1 1 征、格巴氏综合征等。 2
12、 0 0 8 年1 2 月,我国某实验用小型猪种质资源基 地饲养于普通环境中的1 头3 月龄小型猪发生腹 泻,我们对发病小型猪进行剖检观察,并进行细菌分 离鉴定、血清学试验和P C R 检测,确诊为空肠弯曲 菌感染导致的细菌性疾病。这是我国首次从发病小 型猪中分离到空肠弯曲菌,为进一步研究该菌及开 展流行病学调查奠定了基础。 1 材料和方法 1 1 培养基和试剂 C a m p B A P 、N u t r i e n tB r o t hN o 2 为英国O X O I D 公 司产品。M A H 琼脂、M H 肉汤、1 0 甘氨酸、3 5 氯化钠肉汤等培养基,由本所培养基室提供。马尿 酸水
13、解试验试剂购自北京陆桥技术有限责任公司。 微厌氧培养系统由日本三菱瓦斯化学株式会社提 供。药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公 司。d N T PM i x t u r e ,T a K a R aL AT a q 、B a c t e r i a lC , e n o m i c D N AE x t r a c t i o nK i t 、A g a r o s eG e lD N AP u r i f i c a t i o n t 为 T a K a R a 公司产品。 1 2 割检观察 发病小型猪颈部淋巴结肿大、充血;肺脏有充血 现象,细支气管内充斥着浅灰色黏液样物质;胃黏膜 处出
14、现小的溃疡;肠系膜淋巴结有针尖大小出血点 分布;肠内容物为浅灰黄色、水样物,肠黏膜出现多 处小的出血灶。 1 3 细菌学检查 将小型猪麻醉放血完全后剖解,取病变组织做 触片和心血涂片,分别进行革兰染色和碱性美兰染 色,镜检。 分别取病猪淋巴结、肺、胃、肠样本,分别接种 C a m p - B A P ( 已加相关抗生素,为选择培养性基) ,置 4 2 。C 于微厌氧培养系统( 8 5 N :,1 0 C O :,5 0 2 ) 培养4 8 7 2h 。对疑似茵落进行革兰氏染色镜检。 将分离菌株纯化后,用我们制备的空肠弯凿菌抗血 清与分离菌株进行血清凝集试验。挑取单菌落接种 于N u t r i
15、 e n tB r o t hN o 2 中,3 7 微厌氧培养4 8h ,接种 马尿酸水解试剂、尿素、硝酸盐、1 O 甘氨酸、3 5 氯化钠肉汤等反应管进行生化鉴定乜J 。 1 4 P C R 检测 1 4 1 引物设计和D N A 提取:根据已公布的空肠 弯曲菌N C T C1 1 1 6 8 株全序列( G e n B a n k 登录号 N C 0 0 2 1 6 3 ) ,应用计算机辅助软件,针对鞭毛蛋白肛 A 基因区设计引物,预期扩增的基因片段大小为 6 4 0b D 3 。引物由上海生工生物工程公司合成。 F 2 :5 A T G A A A G A A A A C r A I
16、G G C C G C 7 n G T C 7 r 3 ; R 2 : 5 A G T C T A C A T C A C G G A T I T G C G A 7 I T C l B 3 。 对纯培养分离菌株用B a c t e r i a lG e n o m i cD N A E x t r a c t i o nK i t 抽提基因组D N A 。 1 4 2 P C R 扩增及基因序列鉴定:以纯培养分离菌 株染色体D N A 为模板,扩增其鞭毛蛋白肛A 基因 片段。 P C R 反应体系采用5 0 皿,中依次加入如下成 分:5p L1 0x 朋z 幻B u f f e r ( M
17、9 2 + P l u s ) ,8 弘Ld N T P M i x t u r e ( 各2 5m m o l L ) ,1t t L 上游引物( 2 0m o l L ) , 1 肛L 下游引物( 2 0t | m o l L ) ,2 5 汕模板D N A ,0 5 止 T a K a R aL AT a x i ( 5U t t L ) ,3 2 弘L 灭菌双蒸水。 P C R 反应参数为:9 4 预变性5m i n ;9 4 4 5s , 6 0 4 0S ,7 2 1m i n ,共3 0 次循环;最后一次循环 后7 2 。C 再延伸5m i n 。 反应结束后,取5 “L 扩增产
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- 中国 小型 空肠 弯曲 首次 分离 及其 鉴定
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