军团菌MOMPS基因的克隆并在原核系统中表达.pdf
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1、军团菌 MO MP S基因的克隆并在原核系统中表达 * 张雷陈建平王涛张莉田玉 (四川大学 华西基础医学与法医学院 寄生虫学教研室,形态学实验室,成都6 1 0 0 4 1 ) 摘要以军团菌D NA为模板, P C R扩增获得军团菌主要外膜蛋白基因( Ma j o ro u t e rme mb r a n ep r o t e i ng e n e , o mp S ) ,与原核表达质粒p UC 1 8定向重组,构建重组质粒,转化大肠杆菌 B L 2 1 ,并用限制性酶酶切分析、聚合酶链 式反应、核酸序列分析、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、 We s t e r n印迹进行鉴定。实验结
2、果表明我们扩增出 了军团菌9 1 4b p的o mp S基因,成功构建了重组质粒p L P o mp S ,并在原核系统中得到了表达。 关键词军团菌主要外膜蛋白基因( o mp S )克隆表达 C l o n i n go f Ma j o rO u t e rMe mb r a n eP r o t e i nG e n eo f L e g i o n e l l ap n e u mo p h i l a A n dD e t e c t i o no f I t s E x p r e s s i o ni nP r o k a r y o t i cC e l l Z h a n g
3、L e i C h e nJ i a n p i n g Wa n gT a o Z h a n gL i T i a nY u ( De p a r t me n t o fP a r a s i o t o l o g y ,We s t C h i n aMe d i c a l C e n t e r ,S i c h u a nUn i v e r s i t y ,C h e n g d u 6 1 0 0 4 1 , C h i n a ) A b s t r a c t I nt h i ss t u d y ,t h eo mp Sg e n e ,ama j o ro u
4、t e rme mb r a n ep r o t e i ng e n eo f L e g i o n e l l ap n e u mo p h i l a , wa so b t a i n e df r o mt h e D NAo f L e g i o n e l l ap n e u mo p h i l ab yP C R .T h e g e n e wa s c l o n e di n t op r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n a l p l a s mi dp UC 1 8t oc o n s t r u c tr e
5、c o mb i n a n tp l a s mi d .T h er e c o mb i n a n tp l a s mi dwa st r a n s f o r me di n t oE . c o l i s t r a i n B L 2 1 .T h ei d e n t i f i c a t i o nwa sma d eb yme a n so fr e s t r i c t i o ne n z y mea n a l y s i s ,p o l y me r a s ec h a i nr e a c t i o n ,D NA s e q u e n c i
6、n ga n a l y s i s ,S D S- p o l y a c r y l a mi n eg e l e l e c t r o p h o r e s i sa n a l y s i sa n dWe s t e r nb l o t .T h er e s u l t ss h o we dt h a t t h eo mp Sg e n e o f 9 1 4b pwa s a mp l i f i e df r o mL e g i o n e l l ap n e u mo p h i l aD NA,t h e r e c o mb i n a n t p l a
7、 s mi dp L P o mp Swa s c o n s t r u c t e da n di t se x p r e s s i o ni np r o k a r y o t i cc e l l wa sd e t e c t e ds u c c e s s f u l l y . Ke yw o r d s L e g i o n e l l ap n e u mo p h i l a ( L P )Ma j o ro u t e rme mb r a n ep r o t e i ng e n e( o mp S ) C l o n e E x p r e s s i o
8、 n 1 引言 军团病( L e g i o n n a i r e sd i s e a s e , L D )是由军团菌 引起的一种以肺炎为主要表现的急性细菌性传染 病,并常伴多系统损害,病程进展快,病死率高,易暴 发流行。该病原体可侵入巨噬细胞,逃避吞噬体和溶 酶体的杀伤作用,并在其中生长繁殖。军团菌目前已 发现4 2个种, 6 4个血清型 1 。其中引起人类疾病的 主要是是嗜肺军团菌种( L e g i o n e l l ap n e u mo p h i l a , L P ) ,有1 4个型。军团菌o mp S基因编码产生一个 2 8KD a的主要外膜蛋白( Ma j o ro
9、u t e rme mb r a n e p r o t e i nS , MOMP So rOMP S ) ,可聚合形成穿孔素 样结构 2 ,能介导军团菌黏附到巨噬细胞表面,与军 菌 的毒力紧 密相关。本研究 旨 在 构 建 重 组 质 粒 p L P o mp S ,并在原核系统中表达,为进一步分析研 究MOMP S蛋白结构功能、蛋白组学及探讨其致病 *国家自然科学基金资助课题( 3 9 8 7 0 6 5 6 ) 通讯作者。E - ma i l :j p c h e n 0 0 7 1 6 3 . c o m 机制和免疫性提供研究基础。 2 材料和方法 2 . 1 菌株与质粒 军团菌菌株
10、L P 1型标准株及兔抗军团菌抗血 清由中国疾病预防控制中心传染病控制所惠赠,其 中军团菌菌株L P 1型标准株经本室长期传代保存。 军团菌兔血清、 B L 2 1 、 D H5 (携带质粒p UC 1 8 )由本 室保存。 2 . 2 酶及主要试剂 T4D NA连 接 酶 购 自 基 因 试 剂 公 司, E c o R I 、 Hi n d I I I 、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体及其它 试剂均购自天泰生命科技有限公司。 2 . 3 细菌培养 军团菌L P 1型接种于B C YE - 琼脂培养基 3 , 烛缸法培养, 3 7 , 2 3d 。挑取单菌落,用P B S悬 浮细菌,提取其D
11、 NA。 取新鲜B L 2 1菌株接种于L B培养基, 3 7 剧烈 生物医学工程学杂志 JB i o me dE n g = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = 2 0 0 6 ; 2 3 ( 2 ) :3 7 9 3 8 2 振摇培养3h , C a C l 2法制备感受态细胞 4 。 D H5 菌株接种于L培养液, 3 7 , 1 6 1 8h , 收集菌液,用小量碱
12、裂解法提取质粒p UC 1 8 。 2 . 4 o mp S基因的扩增 以提取的军团菌D NA为模板,根据文献报道 的o mp S基因序列,设计合成扩增军团菌o mp S基 因的引物,并分别在5 端加上E c o R I和Hi n d I I I的 酶切位点。上游引物( P 1 ) :5 - AT AG AAT T C G G A- G AAC G G G AT AT G T T T AG,下 游 引 物( P 2 ) :5 - AT AAAG C T T G G G G T T AT T T AG AC A T T G C C 。 扩增条件: 9 4 预变性5mi n ; 9 4 4 5s
13、, 5 8 4 5s , 7 2 4 5s , 3 0个循环;最后7 2 延伸1 0mi n 。 2 . 5 o mp S基因的克隆 用E c o R I和Hi n d I I I双酶切扩增的o mp S基因 及载体p UC 1 8 ,纯化双酶切的产物,并将纯化后的 o mp S及载体p UC 1 8混合, T4D NA连接酶连接, 转 化预先制备的感受态大肠杆菌B L 2 1 ,涂布于含氨苄 青霉素的L B平板(平板内含X - g a l和I P T G) , 3 7 培养过夜。挑取白色菌落、提取质粒进一步鉴定、筛 选阳性克隆。将构建的重组质粒命名为p L P o mp S 。 2 . 6
14、阳性重组质粒的鉴定 2 . 6 . 1 重组质粒的P C R鉴定以重组质粒D NA 为模板,用引物P 1和P 2进行P C R扩增,扩增产物 经1 . 5 %的琼脂糖凝胶电泳鉴定。 2 . 6 . 2 重组质粒的酶切鉴定用限制性核酸内切 酶E c o R I和Hi n d I I I分别对重组质粒D NA进行单 酶切和双酶切,酶切产物经1 . 5 %琼脂糖凝胶电泳 鉴定。 2 . 7 基因序列测定 用M1 3通用引物对经酶切及P C R鉴定正确的 重组质粒p L P o mp S进行测序。 2 . 8 MO MP S的诱导表达及检测 挑选带有p L P o mp S质粒的B L 2 1菌种接种
15、于 5ml含有氨苄青霉素的L B培养液, 3 7 振荡培养 1h ,至OD 6 0 0 0 . 2 ,加 入I P T G(终 浓 度 为0 . 5 mM) , 诱导L a c启动子的表达, 3 7 继续振荡培养5 h , 1 00 0 0r p m, 3 0s离心收集菌体。用1ml P B S悬 浮细菌,再加入1 0 l1 0 g / ml溶菌酶,并加入 D Na s e I ,使其终浓度为1 0 g / ml ,轻轻摇匀,室温 放置5mi n ,然后- 7 0 冰箱至3 7 反复冻融1 0次。 1 20 0 0r p m, 1 0mi n ,收集上清,将蛋白质制备液与2 S D S上样缓冲
16、液等量混匀, 1 0 0 煮沸5mi n , 离 心,取上清2 5 l按L a e mml i法进行S D S - P AG E 5 , 电泳后,电转印到硝酸纤维膜上,进行We s t e r n - b l o t 鉴定,兔抗军团菌抗血清抗体浓度为1 :2 0 0 ,酶标 第二抗体工作浓度为1 :1 0 0 0 。 3 结果 3 . 1 重组质粒p L P o mp S的P C R鉴定 采 用 引 物 P 1和P 2对 所 构 建 的 重 组 质 粒 p L P o mp S进行P C R扩增, 得到一条约9 0 0b p的预 期的D NA片段,与本实验设计相符(见图1 ) 。 图1重组质粒
17、p L P o mp S P C R扩增产物1 . 5% %琼脂糖凝胶电泳 F i g1 1 . 5% a g a r o s e g e le l e c t r o p h o r e s i s f o r P C R p r o d u c t o f r e c o mb i n a n t p l a s mi dp L P o mp S M.D NAMa r k e r D L 2 0 0 0 ; 1 .Ne g a t i v ec o n t r o l ; 2 .P C Rp r o d u c t 3 . 2 重组质粒p L P o mp S的限制性酶切分析 用限制性内切
18、酶E c o R I对所获得的重组质粒 p L P o mp S进 行 的 单 酶 切 分 析,电 泳 结 果 显 示 有 35 0 0b p左右的D NA片段出现, 用限制性内切酶 E c o R I和Hi n d I I I双酶切分析, 电泳结果显示有 20 0 0b p和约9 0 0b p左右的2个D NA片段出现 (见图2 ) 。 3 . 3 o mp S基因序列测定结果 本研究中克隆的o mp S基因全长为9 1 4b p ,其 结构基因为8 9 4b p (含起始密码和终止密码) ,编码 2 9 7个氨基酸。将测序结果通过B l a s t软件进行核酸 相似性检索,结果发现我室保存
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