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1、军 事医学科 学 院院刊 B , d l A a s d Mil Me d S . 1 2 0 0 6年 2 月 第 3 0 卷 。 F 6 2 0 0 6 ; V o 1 3 0 第 1 期 N o 1 一起突发炭疽疫情的诊断和病原的分离鉴定 何君,苏裕心, 王争强, 朱虹, 端青. ( 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室, 北京1 0 0 0 7 1 ) 2 0 0 5 年 6- 7月, 我国河北省承德市围场县发生了一起 疑似炭疽疫情。6月2 9日, 7名村民屠宰一病死牛( 死因不 明) , 其中3人有伤口。7月5日, 有伤口的 3人出现发热, 伤口红肿、 中
2、心变黑, 腋下淋巴结肿大等症状。我所对患者 血清标本及病死牛肉、 屠宰现场带血土壤、 患者伤口结痴等 标本进行了检测, 现将结果报告如下。 1 材料和方法 1 . 1 实验材料 1 . 1 . 1 标本来源 河北省承德市围场县疾病预防控制中心 送检的疑似炭疽患者血清标本5份, 屠宰现场土壤 1 份, 病 死牛肉1 份, 患者伤口结痴 1 份。 1 . 1 . 2菌株炭疽芽抱杆 菌( 简 称炭疽菌 ) 强毒 株 ( 1 7 0 0 3 一 5 9 ) 为本室保存。 1 . 1 . 3 杭原选择炭疽菌强毒株灭活的菌体抗原。 1 . 1 . 4 诊断试p 1 炭疽菌凝集血清为本室制备, 一3 0 保
3、 存; 炭疽快速诊断盒( 胶体金法) , 抗人Ig m荧光抗体试剂为 本室制备; A P I 5 0 C H B / E型生化鉴定系统购自法国梅里埃生 物公司, P C R试剂购自基因生物公司。 1 . 1 . 5 引物引物由北京奥科生物公司合成。炭疽菌保护 性抗原( P A ) 基因引物序列1 : P A - 1 : 5 - T TTC A T T A T G A T - A G A A A T A A C - 3 ; P A - 2 : 5 - T T A T C C T A T C T C A T AG C C I 1 r l 1 - T A G - 3 ; 水肿因 子( E F ) 基
4、因引物 序列 E 2 1 : E F - 1 : 5 - C A A C - G A A G T AC A A T A C A A G A C - 3 ; E F - 2 : 5 一 T A A A T C T A C C T G T C - A T C T C C - 3 o 英膜基因引物序列 ; C A - 1 : 5 - T G C T P F A G C G G T A G C A G A G G C T - 3 ; C A -2: 5 - T G G A C G C A T A C G A G A C A T A - A T -3 。 上述3 对引物扩增产物分别为4 2 3 6 p
5、, 4 9 4如和 3 9 7 b p o 1 . 1 . 实脸动物体质量 1 0 -1 5 g B A L B / c小鼠, 本院实 验动物中心提供。 1 . 2 血清特异性实验方法 1 . 2 . 】 免疫胶体金法用生理盐水将待测血清作 1 : 4 0稀 释, 取巧。 1 i 稀释血清加在炭疽免疫金标诊断试纸的检测 孔中, 2 m in后观察结果, 1 5 m i n 终止。 1 . 2 . 2 免疫荧光法用加热灭活的炭疽菌强毒株( 1 7 0 0 3 - 5 9 ) 菌液涂制抗原片, 室温晾干后火焰固定, 将待检血清用生 理盐水稀释 1 : 2一1 : 1 6 , 分别加人抗原孔 中,
6、3 7 反应 3 0 m in , P B S 冲洗, 加荧光标记抗人I g m, 3 7 反应3 0 m in , P B S 冲洗, 置荧光显微镜下观察。 1 , 3 病原分离 1 . 3 . 1 标本处理将屠宰现场处土壤、 病牛肉、 患者伤口结 痴等送检标本用无菌生理盐水浸泡, 充分振摇静止片刻后取 上清, 6 0 加热3 0 m in , 划线接种血平板, 3 7 C培养。 1 . 3 . 2 动物实验取上述处理的标本上清 0 . 5 m l / 只腹腔 接种小鼠, 2 4 h后用无菌肉汤洗取腹水, 划线接种血平板, 3 7 C 培养, 并取小鼠脏器压片。 1 . 3 . 3 细菌分离
7、 挑选在培养基上生长的可疑单个菌落做 玻片凝集试验, 取阳性的菌落扩大培养, 同时涂片做革兰染 色, 在显微镜下观察其形态。 1 . 4 病原鉴定 1 . 4 . 1 玻片凝集法取洁净玻片, 滴加1滴生理盐水, 用接 种环挑取可疑菌落, 于盐水中混匀, 加一滴炭疽菌凝集血清, 观察凝集现象。 1 . 4 . 2 生化鉴定对凝集试验阳性的菌落扩大培养, 挑取 纯培养的菌落, 稀释菌液至 2个 M c F a r l a n d , 加人 A P I 5 0 C H B / E试纸条,具体步骤按照使用说明进行, 2 4 h后观察 结果。 1 . 4 . 3 P C R 鉴定 挑取凝集试验阳性的菌落
8、加人1 0 0泌 生理盐水, 加1 0 0泌6 m o l / L 的碘化钠, 沸水浴1 0 m i n a P C R 反应体系如下: 取5 闪上清作为P C R 模板, T a q D N A聚 合酶 0 - 2 闪( 5 D / 户) , 1 0 x P C R反应缓冲 液2泌, d N T P I ( 含4 种 核昔酸各2 . 5 m m o l / L ) , 3 对基因的上下游引物( 1 0 p ,m o l/ L ) 各。 . 4闪, 加水至2 5泌 。P A和E F 引物扩增条件如下; 9 4 9 v 预变性2 m i n , 9 4 9 C 4 0 a , 5 8 9 C 4
9、 0, , 7 2 9 0 4 0。 . 共3 5个循环, 7 2 延伸7 min .英膜基因引物扩增条件如下: 9 4 9 C 预变性2 min , 9 4 C 3 0 . , 4 8 C 4 0。 , 7 2 C 4 5 s , 共3 5 个循环 7 2 9C延伸 7 m in 。 反应结束后, 取6 泌产物进行1 . 0 %的琼脂糖凝胶电 泳, 观察结果。 2 结果 2 . 1 血清特异性抗体检测 用免疫胶体金法鉴定, 5 份患者血清标本中有3份呈炭 疽强阳性反应, 1 份呈弱阳性反应。强阳性血清在试纸条检 测孔处出现2条肉眼可见的红色沉淀线, 弱阳性血清虽也出 现 2 条沉淀线, 但颜
10、色较浅; 1 份阴性, 即仅出现 1条沉淀线 ( 质控线) 。免疫荧光检测结果显示 4份血清标本阳性, 1 份 收稿日 期 2 0 0 5 一 l 0一 1 2 汇 作者 简介 何君 ( 1 9 6 4- ) , 女 北京 市人 , 实验 师 南 通讯联系人, d u a n q n ia . b m i 二. n T e l ; ( 0 1 0 ) 6 6 9 4 8 5 6 0 0 军 事医学科 学院 院刊2 0 0 6 年 2 月 第 3 0卷 第 l 期 阴性。两种方法检测结果一致。 2 . 2 炭疽菌的分离鉴定 2 . 2 . 1 动物实脸接种土壤标本的小鼠于2 4 h内死亡, 解
11、剖后取腹水接种血培养基, 同时将接种病牛肉标本和伤口标 本的小鼠断颈处死, 解剖后取腹水接种血培养基, 培养 2 4 h 后土壤标本和病牛肉标本可见单一、 典型的菌落, 而伤口标 本未分离出细菌。 2 . 2 . 2 菌落形态和革兰染色结果在血培养基上菌落呈灰 白色, 粗糙毛玻璃状, 不溶血, 挑取菌落时有拉丝状; 在 1 0 0 倍油镜下可见菌体革兰染色阳性, 长杆状, 呈链状排列。符 合炭疽菌特性。 2 . 2 . 3 凝集试验取土壤标本和病牛肉标本分离培养的菌 落进行玻片凝集试验, 结果为阳性。 2 . 2 . 4 生化试脸经鉴定, 阳性反应的包括: 核糖、 半乳糖、 葡萄糖、 N 一
12、乙酞一 葡糖胺、 熊果昔、 七叶灵、 柳醇、 麦芽糖、 蔗 糖、 海藻糖、 淀粉、 肝糖、 赖氨酸、 鸟氨酸、 柠檬酸钠、 尿素; 阴 性反应有甘油、 赤癣醇, D 一 阿拉伯糖, L 一 阿拉伯搪, D 一 木糖、 L - 木糖、 阿东醇、 p 一 甲 基一 D 一 木糖昔、 果糖、 甘露糖、 山梨糖、 鼠李 糖、 卫矛醇、 肌醇、 甘露醇、 山梨醇, a 一 甲基一 D 一 甘露糖昔、 葡萄 糖昔、 苦杏仁昔、 纤维二糖、 乳糖、 蜜二糖、 菊糖、 松山糖、 棉子 糖、 木糖醇、 龙胆二糖, D 一 松二糖, D 一 来苏糖, D 一 塔格糖, D 一 岩 糖, D一 阿拉伯糖醇, L -
13、 阿拉伯糖醇、 葡萄糖酸盐, 2 - 酮基一 葡萄 糖酸盐、 5 一 酮基一 葡萄糖酸盐、 苯丙氨酸盐、 丙二酸。该反应 类型经A P I V 3 . 3 . 3软件分析鉴定符合炭疽菌特性。 2 . 2 . 5 P C R鉴定从土壤标本和病牛肉标本中分离的细菌 用3 对炭疽菌引物扩增均呈现阳性, 分别在4 2 3 饰, 4 9 4 b y 和3 9 7 b y 处出现特异性目的条带。 3讨论 炭疽菌的分布遍及全世界, 可导致人类和家畜严重疾 病, 多以散发病例和局部爆发为主。炭疽芽抱对外界抵抗力 强, 可在土壤中长期存活。食草动物啃食草根时, 会吸人或 食入土壤中的炭疽菌而感染; 人通过宰食病
14、畜而患病。本实 验室于2 0 0 5年 6 -7月对河北承德市围场县送检的患者血 清标本及病死牛肉、 屠宰现场带血土壤、 患者伤口结痴等标 本进行了炭疽菌病的快速诊断和炭疽菌的分离鉴定。在快 速诊断中免疫胶体金与免疫荧光检测的结果一致, 免疫胶体 金法标本处理简单, 不需调试仪器,2 n u n即可得出结果, 且 结果易读、 客观。为了进一步分离鉴定炭疽菌, 还进行了动 物实验。取实验小鼠的腹水接种在血平板上培养2 4 h后, 土壤标本和病牛肉标本可见单一、 典型的菌落, 菌落形态、 革 兰 染色和生化试验结果符合炭疽菌特性。文献报道炭疽菌 有两个毒力相关质粒p x 0 1 和p X 0 2
15、o p X 0 1 携带c y a , Id和 p a g 基因, 分别编码水肿因子( E F ) 、 致死因 子n ( L F ) 和保护 性抗原( P A ) ; p X 0 2 携带c a p A B C和d e p 基因, 分别编码英 膜 并参与 其酶的生物合成 4 ,6 1 。以这两种质粒为模板进行聚 合酶链反应, 可以用于炭疽菌有毒株的检测。我们对从土壤 和病牛肉标本中分离的 细菌用炭疽菌3 对引物进行P C R鉴 定, 结果均呈阳性。从屠宰现场土壤和病牛肉标本中分离出 炭疽菌, 但患者伤口结痴标本没有分离培养出炭疽菌, 这可 能与患者发病后接受大剂量抗生素治疗有关。 此次事件应引
16、起人们的高度重视, 需进一步加强农村基 层的宜教工作。控制和消除炭疽病的最根本措施是加强对 患病及死亡牲畜的管理以及病畜检疫工作, 严禁屠宰病畜, 对死于炭疽的牲畜尸体要监督焚烧; 对已发生屠宰患病及死 亡牲畜的情况, 应对污染地土壤和可以追查到的皮张进行炭 疽细菌学检查 , 一旦细菌学检查阳性则应及时采取消毒措 施 。 关键词 炭疽芽抱杆菌; 免疫荧光试脸; 免疫胶体金; 聚 合酶链反应; 病原分离鉴定 【 中图分类号 8 3 7 8 . 7 2 文献标识码 A 文章编号 1 0 0 0 -5 5 0 1 ( 2 0 0 6 ) 0 1 -0 0 9 8 -0 2 参考文献 川葛 猛, 徐俊
17、杰, 李冰, 等. 炭疽菌保护性抗原受体结合区的 表达与纯化【 J l .中华微生物学与免疫学杂志, 2 0 0 4 , 1 0 ( 2 4 ) ; 7 9 9 一 8 0 1 . 2 王 津, 宋亚军, 郭兆彪, 等.用复合P C R检侧炭疽芽抱的研 究 J 中国人兽共患病杂志, 2 0 0 2 , 1 8 ( 6 ) : 5 2 - 5 4 . 3 何湘, 黄留玉. 炭疽杆菌致病性研究进展 J 微生物学通 报 ,2 0 0 4 ,3 1 ( 4 ) ; 1 0 1 一 1 0 5 . 4 P a n n i fi o r A D , W o n g T Y , S c h w a rt e
18、 n b a c h e r R , e t a l . C ry s t a l s tru c ture o f th e a n t h r a x l e th a l f a c t o r J . N a t u r e , 2 0 0 1 , 4 1 4 ( 6 8 6 0 ) : 2 2 9 - 2 3 3 . 5 R e i f T C , J o h n s M, P il la i S D, a t a l . I d e n tif i c a ti o n o f c a p s u le -f n r m - i n g B a c i ll u s a n th
19、r a c is s p o r e s w it h th e KR a n d a n o v e l d u a l- p rob e - h y b r id iz a t io n fo rm a t J . A p p l E miro n M i c ro b io l , 1 9 9 4 , 6 0 ( 5 ) : 1 6 2 2一1 6 2 5 . 6 R a m i - V , P a tn a G , G a r r ig u e H , 。 “ . Id e n ti fi c a ti o n a n d c h a m c - t e r iz a t io n o f B a c i ll u s a n th r a c i s b y m u lt ip le x P C R a n a ly s is o f s e - q u e n c e s o n刘 a s m id s p X 0 1 a n d p X 0 2 a n d c h ro m o s o m a l D N A J . F E M S M i c ro b i a l L e tt , 1 9 9 6 , 14 5 ( l ) : 9 一 1 6 . 本文编辑杨兆弘)
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