刚地弓形虫醛缩酶基因及其内含子的分析.pdf
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1、文章编号: 1 0 0 2 - 2 6 9 4 (2 0 0 5) 0 7 - 0 5 8 0 - 0 4 刚地弓形虫醛缩酶基因及其内含子的分析* 余南, 何蔼, 李卓雅, 郑斌, 詹希美* 摘要: 目的刚地弓形虫醛缩酶是其速殖子入侵宿主细胞过程中的一个重要分子, 本研究对该酶基因序列及其内含子 进行实验和分析。方法提取刚地弓形虫R H株速殖子基因组D N A和总R N A, 采用P C R技术分别从基因组D N A和c D N A 中扩增编码果糖1, 6 -二磷酸醛缩酶的基因, 并克隆到T载体上, 经测序鉴定后对其基因组序列和c D N A序列进行比较分析。 通过N C B I数据库资源对醛
2、缩酶内含子的分布及大小进行比较分析。结果根据醛缩酶基因设计的引物从基因组D N A扩增 得到的片段长度为13 1 5b p, 从c D N A扩增得到的片段为9 9 3b p。比对结果显示来源于基因组D N A的序列在对应于编码序 列起始密码子下游1 0 9 b p后有一个3 2 2 b p的内含子。通过在线工具收集得到N C B I及E M B L数据库中来源于不同物种的3 2 种醛缩酶数据, 分析显示推断氨基酸序列具有保守性。结论编码刚地弓形虫 (T o x o p l a s m ag o n d i i) R H株果糖1,6 -二磷酸 醛缩酶基因编码区内存在一个3 2 2 b p的内含
3、子。醛缩酶氨基酸序列保守性较高。内含子在不同进化等级之间插入位置数目 及大小两方面均存在明显的增加趋势。 关键词: 刚地弓形虫; 果糖1, 6 -二磷酸醛缩酶; 内含子 中图分类号: R 3 8 2 . 5 文献标识码: A C h a r a c t e r i z a t i o na n da n a l y s i s o fT o x o p l a s ag o n d i ia l d o l a s e g e n e a n d i n t r o n Y UN a n,H EA i,L IZ h u o - y a,Z H E N GB i n,Z H A NX i - m
4、 e i (D e p a r t m e n t o fP a r a s i t o l o g y,Z h o n g s h a nM e d i c a l c o l l e g e,S u nY a t-s e nU n i v e r s i t y,G u a n g z h o u,5 1 0 0 8 9,C h i n a) A B S T R A C T:A l d o l a s e i sa n i m p o r t a n tm o l e c u l a rw i t h i nt h e i n v a s i o nm e c h a n i s mo f
5、T o x o p l a s m ag o n d i iR Hs t r a i nt a c h y z o i t e s . T h e a i mo f t h e p r e s e n t s t u d y i s t o c h a r a c t e r i z e a n da n a l y z e t h e a l d o l a s e g e n e a n d i t s i n t r o n . T h e g e n o m i cD N Aa n d t o t a lR N Aw e r e e x t r a c t e d f r o mT o
6、 x o p l a s m a g o n d i iR Hs t r a i n t a c h y z o i t e s . B o t h o f t h e g e n o m i cD N Aa n d t h e c D N Aw e r e u s e d a s t e m p l a t e s i nP C Rt o a m p l i f y a l d o l a s e g e n e f r a g m e n t s r e s p e c t i v e l y . T h e t w op r o d u c t sw e r e c l o n e d
7、i n t oTv e c t o r s,a n ds e q u e n c e d . A l i g n m e n t b e t w e e nt h e t w o f r a g m e n t sw a s p e r f o r m e d . S e q u e n c e a n d i n t r o n a n a l y s i sw e r e b a s e d o nN C B I d a t a b a s e a n dE M B Ld a t a b a s e r e s o u r c e . T h e a l d o l a s e g e n
8、 e f r a g m e n t f r o mt a c h y z o i t e s g e n o m i cD N Aw a s t e s t e d 1 3 1 5 b p i n l e n g t h;t h e c o r r e s p o n d i n g o n e f r o mc D N Aw a s 9 9 3 b p i n l e n g t h . T h e a l i g n m e n t s h o w e dd i f f e r e n c e i n t h e 1 0 9 b pd o w n s t r e a mo f o r i
9、 g i n a l c o d e i n c D N A. A3 2 2 b p i n t r o nw a s f o u n d i n t h e c o r r e s p o n d i n g s i t e o f g e n o m i c s e q u e n c e . T h i r t y t w oa m i n oa c i ds e q u e n c e s o f a l d o l a s e f r o md i f f e r e n t o r g a n i s m sw e r e c o l l e c t e df r o mt h e
10、d a t a b a s eo f N C B I a n dE M B L,a n d a n a l y z e d b y t o o l s o f P C G E N Ea n d o n l i n e s o f t w a r e . T h e d i s t r i b u t i o n a n d s e q u e n c e l e n g t h o f t h e i n t r o n sw i t h i n t h e a l d o l a s e g e n e sw e r e a n a l y z e d o n l i n e t h r o
11、 u g hN C B I . T h e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t a l d o l a s e o w n s h i g h c o n s e r v a t i o n i n i t s a m i n o a c i d s e - q u e n c e . O n t h e o t h e r h a n d,t h e a l d o l a s e i n t r o n s f r o md i f f e r e n t e v o l u t i o nd e g r e e o r g a n i s m s
12、a r e v e r y v a r i a b l e i nb o t h i n s e r t s i t e s a n d i n - t r o n s i z e . S i g n i f i c a n t i n c r e a s e s i n s i t e s a n d s i z e o c c u r s a l o n g t h e e v o l u t i o n . K E YWO R D S:T o x o p l a s m ag o n d i i;f r u c t o s e 1,6 - b i s p h o s p h a t e
13、a l d o l a s e;i n t r o n 刚地弓形虫是一种机会性致病原虫, 可主动入 侵多种哺乳动物的有核细胞, 对免疫低下的病人如 爱滋病患者, 则可导致致命的弓形虫脑炎, 同时垂直 传播也可导致婴儿脑炎和眼部疾患。作为主动入侵 的细胞内寄生原虫, 弓形虫机制研究已经有了一定 的积累 1 , 而这方面的研究也具有作为模式生物意 义。弓形虫入侵宿主细胞时需要宿主细胞表面和虫 体的细胞骨架之间相互协调作用。在这个主动穿透 的过程中, 伴随粘附蛋白释放的同时还必须要有动 力系统的活化, 需要依赖其肌动蛋白纤维和肌球蛋 白。已有研究显示弓形虫醛缩酶可能在M I C粘附 蛋白与细胞骨架之
14、间的连接中起重要作用 2 。我 们在对刚地弓形虫R H株醛缩酶基因的研究中发现 其基因组D N A中存在一个比较大的内含子。 内含子是真核细胞基因的一大特点。很久以来 *获中山大学中山医学院科研基金资助。 *通讯作者 作者单位: 中山大学北校区病原生物学教研室, 广东 广州 5 1 0 0 8 9 085 中 国 人 兽 共 患 病 杂 志 C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e s 2 0 0 5,2 1(7) 内含子的起源说法不一, 一种观点认为与基因本身 共同起源, 在原核生物及一些低等生物因适应快速 核酸复制和细胞分裂的需要而失去;
15、另一种观点则 认为内含子的发生是基因在进化过程中逐步出现 的。人们对一些高度保守的氨基酸序列的内含子进 行研究, 取得了一些结果: D i b b 3 通过分析微管蛋白 家族各成员的内含子的分布认为内含子是在进化过 程中插入的; 而B a g a v a t h i 4 对肌动蛋白的内含子分 布的研究则认为物种在进化中会丢失一些内含子, 国内吴加金 5对动物肌动蛋白内含子序列按同亚 型和不同亚型在相同插入位置做比较分析认为相同 亚型的内含子可能从共同祖先进化而来, 不同亚型 的内含子序列则从不同的祖先进化而来。我们在研 究弓形虫的入侵模式中发现其醛缩酶基因存在一个 内含子。考虑到醛缩酶作为糖酵
16、解的代谢酶, 其氨 基酸序列具有高度保守性, 本研究也试图从该酶的 内含子分析出发, 以探讨其在种系发生及进化研究 中的意义。 1 材料与方法 1 . 1 材料 1 . 1 . 1 虫株、 实验动物、 载体及宿主菌刚地弓形虫国际标 准强毒株R H株为本室保种。昆明鼠购自中山大学实验动 物中心。p M D 1 8 - T载体购自大连宝生物工程公司; 大肠杆 菌J M 1 0 9为本室保种。 1 .1 . 2 仪器与试剂 M JR e s e a r c hP T C-2 0 0P C R仪; L K B恒压恒流电泳仪;B i o - R a dM P 3电泳仪及转印设备;T r i - z o
17、l总R N A提取试剂; 逆转录试剂盒;Q i a g e n D N A胶纯化试 剂盒。 1 . 2 方法 1 . 2 . 1 刚地弓形虫R H株速殖子的纯化及其基因组D N A 的提取液氮保存的速殖子经3 7 复苏, 经腹腔注射感染 昆明鼠, 7 2h后收集速殖子。经纯化的速殖子用1 0倍体积 的裂解液 (1 0 mMT r i sC l(p H8 . 0) , 0 . 1 ME D T A (p H8 . 0) , 0 . 0 2 m g m l胰R N A酶, 0 . 5 %S D S,0 . 1 m g m l蛋白酶K) 混 匀, 消化后用酚 氯仿 异戊醇 (2 5 : 2 4 :
18、1) 进行抽提, 乙醇沉 淀, 去离子水或T E溶解沉淀,- 2 0 保存备用。 1 . 2 . 2 总R N A的提取及c D N A的合成按照试剂说明书 进行总R N A的提取及c D N A的合成。 1 . 2 . 3 刚地弓形虫R H株速殖子果糖1, 6 -二磷酸醛缩酶的 基因扩增 根据G e n B a n k上检索到的序列 (A Y 1 5 0 6 6 3) 设计引 物。上游引物为: 5-T A A C T C G A G G C A G C C G A T G A A T C C; 下游引物为T A A G G A T C C A C G T A G C G T T T C T
19、C G -3 。分别 以1 . 2 . 1和1 . 2 . 2所得的D N A为模板, 进行扩增, 反应条件 为: 9 4 预变性3 m i m, 然后进行3 0个循环, 每次循环9 4 变 性4 5 s e c, 6 0 退火4 5 s e c,7 2 延伸2 m i n, 最 后7 2 延 伸 1 0 m i n。P C R产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分离, 并回收扩增产 物的条带。 1 .2 . 4 克隆、 筛选与鉴定按照厂家说明书将胶回收的 P C R产物连接到p M D 1 8 - T载体上, 构建p M D 1 8 - TF N及 p M D 1 8 -Tc F N, 转化感受态大肠
20、杆菌J M 1 0 9, 转化产物转 移到含I P T G、 X - g a l和氨苄青霉素的L B平板上,3 7 过夜培 养。挑取可疑的白斑菌落, 用含抗生素的L B培养液3 7 过 夜培养。对经过抗生素筛选的菌落提取质粒, 进行酶切鉴定 和P C R鉴定。上述鉴定均为阳性的样品送上海博亚生物技 术有限公司测序。 1 . 2 . 5 数据的收集与分析核酸序列比对通过C l u s t a l W进 行; 醛缩酶基因及蛋白序列数据通过N C B I网站在线检索 G e n B a n k数据库和E M B L数据库获得; 推断氨基酸序列比对 分析通过相应在线软件进行。 2 结果 2 . 1 果
21、糖1, 6-二磷酸醛缩酶基因序列 从基因组 D N A和c D N A分别扩增出刚地弓形虫R H株速殖 子果糖1, 6-二磷酸醛缩酶的基因片段, 大小分别 为大约1 3 0 0 b p和1 0 0 0 b p左右, 见图1和图2。经 过抗生素筛选得到若干可疑阳性菌落提取质粒后, 双酶切鉴定和P C R鉴定二者均阳性的克隆送测序 公司测序, 得到2条长度分别为13 1 5b p和9 9 3b p 的序列。核酸序列比对分析发现, 来源于基因组 D N A的序列在起始密码子下游1 0 9b p后有一个 3 2 2 b p的内含子。 图1以速殖子基因组D N A为模板扩增的P C R产物电泳图 M:D
22、 N A分子量标准(D L 2 0 0 0) ;1:扩增产物 F i g . 1 E l e c t r o p h o r e s i sL a po f t h e a l d o l a s e g e n e f r a g L e n t a L - p l i f i e d f r o Lt a c h y z o i t e s g e n o L i cD N A M:D N AM a r k e r (D L 2 0 0 0) ;L a n e 1:P C Rp r o d u c t 图2以速殖子c D N A为模板扩增的P C R产物电泳图 M:D N A分子量标准(D
23、 L 2 0 0 0) ;1:扩增产物 F i g . 2 E l e c t r o p h o r e s i sL a po f t h e a l d o l a s e g e n e f r a g L e n t a L - p l i f i e d f r o Lt a c h y z o i t e s c D N A M:D N AM a r k e r (D L 2 0 0 0) ;L a n e 1:P C Rp r o d u c t 185 2 0 0 5,2 1(7) 中 国 人 兽 共 患 病 杂 志 C h i n e s e J o u r n a l o
24、 f Z o o n o s e s 2 . 2 推断蛋白的序列分析将所得到的编码序列 通过在线翻译工具的分析, 确定一个9 9 3 b p的开放 阅读框, 得到一个3 3 1个氨基酸残基的推断序列, 其 残基组成与G e n B a n k上报道的3 6 3残基的完整序 列 (A Y 1 5 0 6 6 3 . 1) 的相应序列一致。该序列在N C B I 进行B L A S T P, 收集到3 2条同源序列 (表1) , 包括 进化上等级低的原生动物, 也包括进化程度较高的 植物, 动物, 以及人。氨基酸序列均在3 5 0到3 6 9个 残基之间, 大部分在3 6 3左右; 序列相似性均在
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- 弓形虫 醛缩酶 基因 及其 内含 分析
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