三种胶原壳聚糖多孔支架组织相容性的初步研究.pdf
《三种胶原壳聚糖多孔支架组织相容性的初步研究.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《三种胶原壳聚糖多孔支架组织相容性的初步研究.pdf(5页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、三种胶原三种胶原- - 壳聚糖多孔支架组织相容性的初步研究壳聚糖多孔支架组织相容性的初步研究 胡学庆1韩春茂1石海飞1马列2高长有2 【摘 要】目的制备3种具有良好稳定性的胶原-壳聚糖多孔支架,初步探讨其植入体内后的组织相容性。 方法冻干法制备胶原-壳聚糖多孔支架,分别采用真空干热和戊二醛对其交联,制备未交联(材料1 ) 、真空干热交联(材 料2 )和戊二醛交联(材料3 ) 3种胶原-壳聚糖多孔支架,扫描电镜观察支架微观结构。将1 2只家兔随机分为4组( n =3 ) , 3 种支架材料分别交叉埋植入1 2只家兔耳背部皮下,术后观察、记录全身情况及手术区变化,分别于术后3 、 7 、 1 4及
2、2 8d组 织切片下见3种材料的稳定性和组织相容性。结果扫描电镜下见3种支架均具有三维多孔结构,孔径分别为1 2 0 1 0 、 8 0 1 5和1 7 0 2 0 m,孔隙率均大于9 0 %。大体观察:实验家兔术后全身情况良好,手术区红肿轻微,切口均愈合良 好。组织学观察:材料1降解吸收迅速,能引起明显的炎性反应,材料2降解较快,炎性反应不及材料1明显,材料3降解较 慢,炎性反应轻微,术后组织再生较快。结论胶原-壳聚糖多孔支架具有适合组织再生的三维多孔结构,交联能提高 胶原-壳聚糖多孔支架的早期稳定性和组织相容性,戊二醛交联优于真空干热交联。 【关键词】 胶原壳聚糖真皮替代物组织相容性 中图
3、分类号:R 3 1 8 . 0 8 R 6 2 2 . 1文献标识码: A P R I MA R Y S T U D Y O N HI S T O C O MP A T I B I L I T Y O F T HR E E KI N D S O F C O L L A G E N- C HI T O S A N P O R O U S S C A F F O L D S /HUXu e q i n g ,HAN C h u n ma o ,S HIHa i f e i ,e t a l .De p a r t me n t o fB u r n ,S e c o n dA f f i l i
4、a t e dHo s p i t a l o f Z h e j i a n gUn i v e r s i t y , Ha n g z h o uZ h e j i a n g ,3 1 0 0 0 9 ,P.R .C h i n a C o r r e s p o n d i n ga u t h o r :HAN C h u n ma o ,E - ma i l :h a n c mma i l . h z . z j . c n 【 A b s t r a c t 】O b j e c t i v e T oc o n s t r u c t t h r e ek i n d s
5、o f c o l l a g e n - c h i t o s a np o r o u s s c a f f o l d s wi t he n h a n c e db i o s t a b i l i t y a n dt oi n v e s t i g a t et h eh i s t o c o mp a t i b i l i t yo ft h es c a f f o l d si nv i v o .Me t h o d s C o l l a g e n - c h i t o s a np o r o u ss c a f f o l d swe r e f
6、a b r i c a t e db yf r e e z e - d r y i n gme t h o d ,c r o s s - l i n k e du s i n gd e h y d r o t h e r ma l t r e a t me n t a n dg l u t a r a l d e h d e ,r e s p e c t i v e l y .T h e mo r p h o l o g yo ft h eu n c r o s s - l i n k e ds c a f f o l d ( s c a f f o l d 1 ) ,d e h y d r
7、o t h e r ma l l yc r o s s - l i n k e ds c a f f o l d ( s c a f f o l d 2 )a n d g l u t a r a l d e h d ec r o s s - l i n k e ds c a f f o l d( s c a f f o l d3 )wa ss t u d i e db ys c a n n i n ge l e c t r o nmi c r o s c o p y .T h r e ek i n d so f s c a f f o l d s we r ee mb e d d e ds u
8、 b c u t a n e o u s l yo nd o r s a l s u r f a c eo f 1 2r a b b i t e a r s .T h eg e n e r a l a n dl o c a l r e s p o n s e s we r er e c o r d e dd a i l y . T h eb i o s t a b i l i t ya n dh i s t o c o mp a t i b i l i t yo f t h es c a f f o l d s we r eo b s e r v e db yu s i n gHEs t a
9、i n i n ga f t e r 3 ,7 ,1 4a n d2 8d a y s o f o p e r a t i o n .R e s u l t s T h es c a f f o l d sh a dt h r e e - d i me n s i o n a lp o r o u ss t r u c t u r e swi t hap o r o s i t yo fmo r et h a n9 0 %,a n d p o s s e s s e dp o r es i z e so f 1 2 0 1 0 m,8 0 1 5 m a n d1 7 0 2 0 m,r e
10、s p e c t i v e l y .Al l e x p e r i me n t a l r a b b i t ss u r v i v e dwi t h g o o dg e n e r a lc o n d i t i o nd u r i n gt h es t u d y .Al ls k i ni n c i s i o n sh e a l e dwe l lwi t h o u to b v i o u sr e a c t i v er e do rs we l l i n g . Hi s t o l o g i c a l s t u d ys h o we d
11、t h a t s c a f f o l d1wa s d e g r a d e dr a p i d l ywi t ho b v i o u s i n f l a mma t i o n .T h ed e g r a d a t i o no f s c a f f o l d2 wa ss l o we rt h a nt h a t o f s c a f f o l d1a n dt h ei n f l a mma t i o no f s c a f f o l d2wa sa l s omi l d e r t h a nt h a t o f s c a f f o
12、l d1 .S c a f f o l d3 p o s s e s s e ds l o wd e g r a d a t i o np r o p e r t ywi t hs l i g h t i n f l a mma t o r yr e a c t i o n ,a n dr a p i dt i s s u er e g e n e r a t i o n .C o n c l u s i o n T h e c o l l a g e n - c h i t o s a np o r o u ss c a f f o l d sh a v et h r e e - d i m
13、e n s i o n a l p o r o u ss t r u c t u r e st h a ta r es u i t a b l ef o rt i s s u er e g e n e r a t i o n . T h eb i o s t a b i l i t ya n dh i s t o c o mp a t i b i l i t yo ft h es c a f f o l d sa r ee n h a n c e da f t e rc r o s s - l i n k e d .G l u t a r a l d e h d ec r o s s - l
14、i n k e di s b e t t e rt h a nd e h y d r o t h e r ma l l yc r o s s - l i n k e d ,wh i c hc a nf a c i l i t a t ed e r ma l t i s s u er e c o n s t r u c t i o n . 【 Ke yw o r d s 】C o l l a g e nC h i t o s a nD e r ma l s u b s t i t u t eHi s t o c o mp a t i b i l i t y F o u n d a t i o n
15、i t e ms :Na t i o n a lNa t u r a lS c i e n c eF o u n d a t i o no fC h i n a( 5 0 1 7 3 0 2 4 ) ; Na t u r a lS c i e n c eF o u n d a t i o no f Z h e j i a n gP r o v i n c e ( 3 0 2 0 3 6 ) 皮肤创面的修复和愈合是外科领域的基本问题, 组织工程皮肤的出现为大面积烧伤治疗,以及皮肤慢 基金项目:国家自然科学基金资助项目( 5 0 1 7 3 0 2 4 ) ;浙江省自然科 学基金资助项目( 3 0
16、 2 0 3 6 ) 作 者 单 位: 1浙 江 大 学 医 学 院 附 属 第 二 医 院 烧 伤 科(杭 州, 3 1 0 0 0 9 ) ; 2浙江大学高分子科学与工程学系 通讯作者:韩春茂,教授,博士导师,研究方向:组织工程 瘢痕防治 营养代谢,E - ma i l :h a n c mma i l . h z . z j . c n 性创面和瘢痕防治提供了新的解决途径。其中,可降解 组织工程真皮支架材料的研制是组织工程皮肤开发的 要素之一,它为细胞提供黏附和生长的三维空间,在体 内组织再生过程中发挥着重要作用。 胶原是真皮细胞外基质的主要成分,胶原-氨基葡 聚糖多孔支架已经在国外成为
17、真皮支架研究的主流成 分,如国外成熟产品I n t e g r a是由胶原和硫酸软骨素组 628C h i n e s eJR e p a r a t i v ea n dR e c o n s t r u c t i v eS u r g e r y ,2 0 0 5 ,Vo l 1 9 ( 1 0 ) 成,但价格十分昂贵。因此,开发一种价格低廉,又能够 满足生物学和临床要求的真皮支架产品十分重要。我 们的实验采用胶原和壳聚糖为基础制备多孔支架,并 对不同类型的胶原-壳聚糖多孔支架进行稳定性和组 织相容性的初步研究。 1 材料与方法 1 . 1 主要材料 0 . 2 5 %胰蛋白酶( Amr
18、 e s c o公司,美国) ,壳聚糖 ( S i g ma公司, 美国) ,戊二醛(上海化学试剂采购供应 五联化工厂) 。 1 . 2 胶原提取 取新鲜牛跟腱,去杂质,冷冻下捣碎, 0 . 2 5 %胰蛋 白酶3 7 消化2 4h ,三蒸水反复清洗后将腱组织用3 % 乙酸溶液4 溶胀7 2h ,离心弃沉淀,5 %Na C l溶液盐 析上清,沉淀物再经3 %乙酸溶胀、离心、盐析,最后溶 胀液于三蒸水中透析袋4 透析7 2h , 1 2h换水,透析 得到的胶原冷冻干燥后保存备用。 1 . 3 3种胶原- 壳聚糖多孔支架的制备 1 . 3 . 1 胶原-壳聚糖多孔支架用3 %乙酸溶液分别 配制0
19、. 5 %胶原溶胀液和壳聚糖溶液,按体积比9 :1 将胶原溶胀液和壳聚糖溶液充分混匀。将混合液加入 模具, -2 0 冷冻1h ,冷冻干燥机中冻干2 4h制成厚 约1mm的多孔支架。 1 . 3 . 2 真空干热交联胶原-壳聚糖多孔支架胶原- 壳聚糖多孔支架于1 0 5 ,真空烘箱( 2 0P a )中干热 交联2 4h 。 1 . 3 . 3 戊二醛交联胶原-壳聚糖多孔支架真空干热 交联后胶原-壳聚糖多孔支架以0 . 2 5 %戊二醛溶液4 交联2 4h ,三蒸水充分漂洗后再次冻干。 1 . 4 动物模型的建立 将3种支架材料剪成0 . 5c m1 . 0c m大小, 7 5 % 酒精浸泡3
20、 0mi n , P B S冲洗5遍备用。实验用健康家兔 1 2只,雌雄不限;体重2 . 0 5 2 . 5 5k g (浙江大学医学 院动物中心提供) 。耳背部剃毛, 1 0 %氯胺酮耳缘静脉 注射麻醉( 3 0mg / k g ) 。常规消毒铺巾,于耳背血管稀 疏处切口,长约1c m,切开皮肤全层后分离皮下层形成 一腔隙,每只耳背2个腔隙。家兔随机分为4组( n =3 ) 共1 2个埋植点。将3种胶原-壳聚糖多孔支架各4个, 交叉埋植于兔耳背腔隙,同一种材料不埋植于同一兔 耳,即同1只兔3种材料均有埋植,以尽可能减少实验 家兔个体不同的影响。缝合切口,于手术当日至术后2 d肌注青霉素8 0
21、万U/ d , 术后分笼单独饲养。 1 . 5 观测指标 1 . 5 . 1 3种支架的断面微结构表征 扫描电镜对3种 材料的断面进行微结构观察。在支架扫描电镜图中随 机选择1 0个孔,采用直尺测量每一孔径大小,经统计 分析获得支架的平均孔径。材料秤重后(干重, W0)室 温下置无水乙醇中浸泡2 4h ,再次秤重(湿重, W) ,按 以下公式计算材料孔隙率:孔隙率( %) = ( W-W0) 1/ 1W+( 2-1) W0 1 0 0 %,其中1为胶原密度 ( 1 . 2 1g / ml ) , 2为乙醇密度( 0 . 7 9g / ml ) 。 1 . 5 . 2 大体观察术后每天观察实验兔
22、,记录全身情 况及手术区变化。 1 . 5 . 3 组织学观察于术后3 、 7 、 1 4及2 8d任选1组 家兔,麻醉下切取植入支架部位的全层兔耳组织,常规 固定,脱水,石蜡包埋,切片,行HE染色,光镜下观察。 炎性反应分级: 级为材料周边及内部未见或仅见少 量炎性细胞; 级为材料周边及内部可见少量炎性细 胞; 级为材料周边及内部可见明显炎性细胞; 级为 中性粒细胞、淋巴细胞浸润材料全层,材料网孔内充满 炎性细胞 1 , 2 。 2 结果 2 . 1 3种支架断面微结构表征 3种材料均具有三维多孔结构,胶原- 壳聚糖多孔 支架经真空干热交联后,孔径大小有所变化,但仍保持 三维多孔结构;而经戊
23、二醛交联后,支架内部孔径变 大,且主要以片状结构为主,孔径分别为1 2 0 1 0 、 8 0 1 5及1 7 0 2 0 m,孔隙率均大于9 0 %,制备因素对其 无明显影响(图1 ) 。 2 . 2 大体观察 术后所有兔一般情况良好,进食佳。术后2 3d , 手术区出现轻微红肿,其中埋植材料1处的皮肤有2处 于第3天出现坏死,范围与所植入的材料面积一致,其 余切口均愈合良好。4 5d ,术区红肿消退,皮肤因其 下方埋植材料而隆起高出周围皮肤,并随时间的推移 逐渐降低。7d ,取材时发现材料1支架网孔塌陷呈不 定型乳白色物质,质地脆,易碎裂;材料2 、 3呈完整的 结构,与皮肤连接紧密。2
24、8d , 3种材料均明显被吸收 替代,体积缩小,术区皮肤高度基本与周围皮肤一致。 2 . 3 组织学观察 术 后3d ,材料1 :结构尚能辨别,可见大量中性粒 细胞、淋巴细胞浸润到支架网孔及周围,呈明显的急性 炎性反应,炎性反应为级,未见成纤维细胞长入支架 网孔内(图2a ) ;材料2 :网孔结构可见,有较多淋巴细 胞浸润,但不及材料1明显,炎性反应为介于、 级 之间,网孔内亦未见成纤维细胞长入(图2b ) ;材料3 : 网孔结构清晰,炎性反应为级(图2c ) 。7d ,材料1 : 728 中国修复重建外科杂志2 0 0 5年第1 9卷第1 0期 图1 3种胶原-壳聚糖多孔支架断面微结构(扫描
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 胶原 聚糖 多孔 支架 组织 相容性 初步 研究
链接地址:https://www.31doc.com/p-3701180.html