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1、 2 0 0 8 年2 月 第 1 8 卷第 2 期 中国比较医学杂志 C H I N E S E J O U R N A L O F C O M P A R A T I V E M E D I C I N E F e b r u a ry, 2 0 0 8 V o l . 1 8 N o . 2 SS f #6邵 啄. 之 ,七 ; 、 才 不同取卵时间对兔 I C S I 胚胎体外发育的影响 陈浩杰 ,2 , 刘丽均2 , 李晨阳 , 赵立虎 ,2 , 徐平2罗光彬 ( I . 沈阳农业大学畜牧兽医学院, 沈阳1 1 0 1 6 1 ; 2 . 中国科学院上海实验动物中心, 上海2 0 1
2、 6 1 5 ) 摘要】 目的 探讨不同取卵时间对兔I C S I 胚胎体外发育的影响。方法采用P i e 二操作系统对实验兔进行 辅助体外受精。结果b C G注射后 1 4 , 1 6 , 1 8 h 取卵, I C S I 后的受精率分别为8 2 . 2 %, 7 5 . 9 %和0 . 0 % n , 对受精卵进行 体外发育培养, 桑堪胚的发育率分别为7 2 . 9 %, 7 0 . 0 %, 0 . 0 %, 囊胚的发育率分别为6 2 . 2 %, 5 3 . 3 %, 0 . 0 %, 1 4 h 和 1 6 h 之间受精率、 桑根胚率、 囊胚率差异不显著( p 0 . 0 5 )
3、, 但是1 4 h 采卵比1 6 h 要好; 1 8 h 和1 4 h , 1 6 h 之间差异显 著 ( P 0 . 0 5 ) b e t w e e n 1 4 h a n d 1 6 h g r o u p s , b u t w e re s i g n if ic a n t ly d i ff e r e n t ( P 2 0 0 4 一 0 0 0 5 0 1 . 1 . 2 试剂: 培养液: 采用 M T C M 1 9 9为胚胎培养 液, 以 T C M 1 9 9为基础液, 加入 1 0 %的 F C S , 1 . 2 5 m m o l/ L N a - P y r
4、 u v a t e , 0 . 1 m m o l / L E D T A , 7 5 m g / L p e n i c i ll i n 和5 0 m g / L s t r e p t o m y c i n 混合而成, 经0 . 2 2 ta m 醋酸纤维素膜 ( L i f e S c i e n c e s ) 无菌过滤。激素: F S H和h C G , 宁波第二激素厂生产。 1 . 1 . 3 主要仪器、 设备: P i e z o P M M - 1 5 0 F U操作系 统: 购自日 本 P r i m e T e c h L T D公司。持卵针和注射针 的准备: 玻璃毛
5、细管 ( 美国 S U T T E R公司)为内径 0 . 7 5 m m , 外径1 m m的硅化玻璃毛细管, 持卵针规 格: 外径8 0 一 1 2 0 t a m 、 内 径2 0 一 3 0 ji m , 弯至一定的 角度; 注射针规格: 外径约1 0 ta m , 平口, 弯1 0 0 角度, 现拉现用。其他: C O : 培养箱 ( H e r a c e ll , K e n d r o ) , 实体显微镜 ( N i k o n , S M Z 6 2 4 ) , 倒置显微镜 ( L e i c a , 5 2 1 6 6 5 ) , 嘴吸式移液器( S i g m a ) 等
6、。 1 . 2 1 . 2. 1 方法 微镜下捡出经酶消化的卵母细胞, 用 M T C M 1 9 9 液 洗涤3 次, 移人在3 8 9 0 , 5 % C O : 培养箱中 平衡1 2 h 以上的M T C M 1 9 9 的培养液滴中。 1 . 2 . 2 精子的准备: 用假阴道采集公兔精液, 镜检 精子活力在0 . 8以上的用于实验。在 1 . 5 m L离心 管中加人3 8 o C 预热的D - P B S 液1 m L , 然后用移液枪 在离心管底部加入5 0 p .L 精液, 放人培养箱中让精 子上游 1 0 m i n . , 然后吸取上层精子用于注射。 1 . 2 . 3 I
7、 C S I 操作: 用直径 1 0 0 m m的细胞培养皿 ( F a l c o n ) 上盖作为I C S I 操作皿; 用嘴吸式移液器将 5 一 1 0 枚卵母细胞移人操作液滴中, 然后用注射针 抓取一个精子放人第三个 P V P 液滴中, 用针尖在精 子尾部迅速划过进行制动, 看到尾部打折即可, 随后 从尾部吸人注射针内。注射时第一极体在 1 2 点钟 位置, 从 3 点钟的位置进针, 同时用 P i e z o 脉冲击穿 透明带, 继续进针至针尖贴近对侧质膜时, 用弱脉冲 击穿透卵母细胞质膜, 将精子吐出; 回吸胞浆以刺激 激活, 然后和精子一起注人卵内, 轻轻退针, 完成 1 次
8、注射。依次操作, 每次注射从开始制动到注射完 毕在2 m i n 内完成, 所有显微操作在室温下完成。 1 . 2 , 4 受精卵和孤雌活化卵的判定标准: 注射后 6 一 8 h 检查原核和第二极体形成情况, 只有当出现2 原核2 极体 ( 2 P N , 2 P B ) 时判定为受精; 当出现 1 原 核 1 极体 ( I P N , I P B ) , 1 原核 2 极体 ( 1 P N , 2 P B ) , 2 原核 1 极体 ( 2 P N , 1 P B ) 时判定为活化。 1 . 2 . 5 受精卵的培养: 显微注射后, 注射卵经培养 液洗涤3次后, 移入平衡好的培养液微滴中,
9、放在 3 8 . 5 9 0 , 5 % 0 0 2 , 1 0 0 % 湿度下的培养箱中培养3 一 4 d , 培养6 一 8 h 后观察原核和第二极体形成情况, 每 隔1 2 h 观察并记录卵裂情况, 间隔2 4 h 换液, 适时 照相。 1 . 3 统计学方法 采用卡方 ( 2x) 检验对实验结果进行显著性分 析, 以 P 0 . 0 5 ) ; 1 8 h 取 的卵注射后不能受精, 与 1 4 h 和1 6 h 差异显著 ( P 0 . 0 5 ) 。可见, 注射 h C G后 1 4 h 和 1 6 h 取卵都可 以, 但是 1 4 h 取卵最佳。 万方数据 中国比较医学杂志2 0
10、0 8 年 1 月第 T :3 卷第2 期C h i n J C o m p M e d , F e b r u a r y 2 0 0 8 , V o l . 1 8 . N o . 2 表1 不同取卵时间对 I C S I 胚体外发育的影响 T a b . 1 E ff e c t o f d i ff e re n t c o ll e c t i n g t i m e o f r a b b i t o o c y t e s i n v i v o m a t u r a t i o n o n d e v e l o p m e n t o f I C S I e m b ry
11、o m v i t ro 取梦 目 时间( h ) M e t i m e o f o o c y t e c o l l e c t i o n 卵母细胞数 N o . o f o o c y t e s 受精率/ % F e rt i l i z a t i o n r a t e 8 2 . 2 ( 7 4 / 卿) “ 7 5 . 9 ( 6 0 / 7 9 ) 0 . 0 6 桑根胚率1 % Mo r u l a e r a t e 囊胚率/ % 7 2 . 9 ( 5 4 / 7 4 ) “ 7 0 . 0 ( 4 2 / 6 0 ) 0 . 0 6 B l a s t o c y
12、 s t r a t e 6 2 . 2 ( 4 6 / 7 4 ) 5 3 . 3 ( 3 2 / 6 0 ) 0 . ( ) 6 卯7963 4UQ卜 .且.几曰.1 注: 不同字母差异显著。 N o t e : D iff e r e n t l e t te rs i n d ic a t e s s ig n if i c a n t d iff e r e n c e , P 0 . 0 5 3 讨论 卵母细胞的成熟一般在概念上分为核成熟和胞 质的成熟。核成熟表现为减数分裂的恢复、 生发泡 破 裂 ( g e r m i n a l v e s i c l e b r e a k
13、d o w n , G V B D ) 和第一极 体排出, 静止于第2 次减数分裂中期 ( M i l 期) ; 胞 质的成熟内容更为复杂, 是指胞质为受精和胚胎发 育所做的准备, 紧密结合着生化分子和细胞的改变, 以确保胞质内双极纺锤体和线状排列的染色体的形 成, 支持正常的受精和胚胎发育。这两个过程密不 可分。在体内二者协调进行。核成熟进程影响细胞 质成熟, 而细胞质成熟对细胞核成熟又具有促进作 用, 核成熟的完成并不能保证细胞质的正常成熟 2 1 0 另外, 越来越多的证据显示在成熟过程中卵膜表而 发 生T 修 饰和改 变, 即 膜 成熟 3 1 o R e y n ie , 等 采 用
14、 R T - P C R 技术对4 3 例患者 1 1 3 个未受精卵内平均 m t D N A ( 线粒体D N A ) 拷贝数进行分析, 发现其明显 低于正常受精人群, 这种减少提示卵母细胞胞浆不 成熟, 因而影响受精。另有研究发现: 在受精失败的 卵母细胞中, 常可见染色体分布、 纺锤体结构、 C G s ( 皮质颗粒) 排放及分布异常的情况, 这表明胞浆、 胞核成熟障碍可导致受精失败5 1 0 本实验采用的是P i e z o 操作系统, 其受精率比同 样条 件 下, N . O g o n u k i 等 6 1 所报道的 受精率( 8 9 % ) 和囊胚率 ( 6 6 %)稍低,
15、但是比M an q i D e n g an d X ia n g z h o n g Y a n g 7 1 使用 常 规 注 射 法, 取得的 受 精 率 ( 7 8 %) 和囊胚率 ( 3 9 %)高。从实验结果可以看 出, h C G注射后1 4 h 收集的卵母细胞, I C S I 后受精率 比1 6 h 高, 1 8 h 收集的卵母细胞, 注射后已经不能 受精。精核去浓缩和原核形成是胚胎发育所必需的 过程, 雄原核形成失败与卵母细胞中谷胧甘肤活性 低有关, 它的活性是在卵母细胞成熟期间获得的, 随着卵龄的增加其活性降低。在体外成熟期间, 谷 肤甘肤含量不充分或成熟后随着卵龄其被消耗
16、都可 能损害雄原核的发育, 从而造成受精率降低a l 0 h C G注射后1 4 h 收集的卵母细胞, 其注射后囊胚率 比1 6 h 的高, 暗示I C S 1 胚胎随着卵龄的增加其发育 率降低。另外, 在刚成熟的卵母细胞中, 减数分裂的 纺锤体靠近第一极体的位置, 随着卵龄的增加其位 置发生改变。注射卵龄大的卵可能增加损伤纺锤体 的机会, 纺锤体的损伤会降低 I C S I 胚胎的发育潜 能。 参考文献: 1 Y a n a g i m a c h i R . G a m e t e m a n ip u l a t i o n f o r d e v e l o p m e n t : ,
17、 m e t h o d s f o r c o n c e p t i o n J . R e p o r d F e rt i l D e v , 2 0 0 1 , 1 3 ( l ) : 3 一 1 4 . 2 陈大元, 孙青原, 李光鹏, 等, 受精生物学【 M l . 北京: 科学出 版社, 2 0 0 0 , ( 8 ) : 1 5 4 一 1 5 5 . 3 C h ia n R C , B u c k e tt W M , T a n S L . I n - v it r o m a t u r a t i o n o f h u m a n o o c y t e s J
18、l . R e p r o d u c t i v e B i o M e d ic i n e O n l i n e , 2 0 0 3 , 8 ( 2 ) : 1 4 8 - 1 6 6 . 4 。P , M a y - p a n l o u p P , C h r e t e in MF , e t a l . Mi t o c h o n d r i a l D N A a ff e c t s th e f e rt i l ira b i l it y o f h u m a n o o c y te s J l . M o l H u m . 2 0 0 1 . 7 : 4
19、2 5一4 2 9 . 5 F , A u b r i o t F X, G l i o o c y t e s m e t a p h a s e s s a n t A, 朴咧恤buman i n f e r ti l i ty J . H u m R e p m d , s t a g e 2 田 3, :t a l . M u l t i p a r a m e t e r a f t e r I V F f a i l u r e i n a n a l y s i s o f n o n - ma l e 6 O g o n u k i N , I n o u e K , M i
20、k i H , e t a l . 4 9 4一! 5 0 3 . D i ff e re n t i a l d e v e l o p m e n t o f r a b b i t e m b ry o s f o ll o w i n g m i c ro i n s e m i n a t i o n w i t h s p e r m a n d s p e r n a t i d s J . M o l e c R e p r o d D e v , 7 D e n g M Q , Y a n g X Z . 2 0 0 5 , 7 2 : 4 1 1 一 4 1 7 . F u
21、 ll t e r m d e v e l o p m e n t o f r a b b i t o o c y t e s f e r ti l iz e d b y in t r a c y t o p l a s m i c s p e r m i n j e c t i o n J . M o le c R e p r o d D e v , 2 0 0 1 , 5 9 : 3 8 一 4 3 . 幻Z h e n g Y L , J i n g M X , Z h a n g Y L , e t a l . E ff e c t s o o c y te a g e , c u m u l u s c e l l s a n d i n j e c t i o n m e t h o d s o n i n v i t ro d e v e l o p m e n t o f i n t r a c y to p l a s m i c s p e r m i n j e c t i o n r a b b it e m b ry o s J . Z y g o t e , 2 0 0 4 , 1 2 : 7 5 一8 0 . 修回日期 2 0 0 7 - 1 0 - 3 0 万方数据
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