不同年龄大鼠组织端粒酶活性变化的研究.pdf
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1、中华神经医学杂志2005年6月 第4卷 第6期Chin J N-./01-23 J.n- 20054 506744 N08 6中华神经医学杂志2005年6月 第4卷 第6期Chin J N-./01-24 J.n- 20054 506 44 N08 6 基金项目:国家自然科学基金9:02;04粤 财企9200?=:6;、9200:=200, 8?- +)/4脑组织置 无菌JKK-n20LL管中备用。 487睾丸组织取材:剪开阴囊皮肤及皮下组织,取 一个完整睾丸置无菌JKK-n20LL管中备用。 587骨髓组织取材:分离两侧股骨和胫骨,去除骨 两端,生理盐水反复冲洗骨髓腔,收集冲洗液,;7000
2、7 /1in,离心;071in,弃上清,备用。 皮肤、肌肉、脑和睾丸组织入液氮速冻,-M07冻 存。 骨髓组织直接行端粒酶提取。 四、端粒酶提取 ;87冰冻组织样本:切成;0N;5 1厚的切片,取 大约5ND片置于含200 ?冰预冷细胞裂解液的 JKK-n20LL管中。 28 骨髓组织样本:加200 ?冰预冷细胞裂解液 重悬。 冰上孵育0 1in,4 ,;2 000 /1in、 离心20 1in ,取 ;D5 ?上清移入另一JKK-n20LL管中;液氮 中速冻后,-M0 冻存;取;0 ?上清液,加入O0 ? 灭菌双蒸水,行组织蛋白定量。 五、组织蛋白定量分析 取考马斯亮蓝PF250染液;80
3、1?置于玻璃试管 中;加入;00 ?组织匀浆液,混匀,室温放置;0 1in; 紫外分光光度计测定Q:值=波长5O5 n1C,以溶剂为 空白对照。 以牛血清白蛋白=;N50 BC为标准品绘制 标准曲线,依据标准曲线计算组织匀浆蛋白含量。 六、 RCSFJ?T9U法检测组织端粒酶活性 ;8 端粒重复序列的扩增:取25 ?反应混合液, 以每个样本5 B组织蛋白计算, 分别加入组织提取 液,22G2Q定容至50 ?;RCS 扩增:25 引物延伸 25 1in,O4 灭活端粒酶5 1in,然后O4 、0 I,50 、 0 I,D2 、O0 I,0个循环,D2 延伸;0 1in。 28 J?T9U定量检测
4、:取20 ?变性液,加入5 ? RCS扩增产物,室温孵育;0 1in;加入225 ?杂交 缓冲液,混匀;取;00 ?杂交混合液置于微量滴定板 中,D ,孵育2 h;250 ? 漂洗缓冲液漂洗次;加入 ;00 ? 抗地高辛FRQ:工作液, 室温孵育0 1in;250 ? 漂洗缓冲液漂洗5次;加入预热的;00 106? VWX 底物溶液,室温振荡20 1in;加入;00 ?中止反应液 终止反应;酶联免疫检测仪检测=波长450 n1C。 8 端粒酶活性评价:阳性对照Q:值应Y;85,阴 性对照Q:值应Z0825,待检标本Q:值减阴性对照 Q:值Y082为端粒酶阳性。 七、统计学分析 采用99R9;0
5、80统计软件, 对结果行单因素方差 分析。 结果 不同年龄皮肤、肌肉、脑、骨髓和睾丸组织端粒 酶活性结果表明,新生组皮肤、肌肉和脑组织中均有 端粒酶活性表达,其中脑组织和肌肉组织活性较高, 分别为;80;6和08M2O,而皮肤组织端粒酶活性较低, 仅为0854, 与其余各年龄组相比, 差别显著=PZ 080;C;随着年龄的增长,皮肤、肌肉和脑组织端粒酶 活性明显下降,一月龄以后,这三种组织基本不表达 端粒酶活性。 一月组至二年组,骨髓组织的端粒酶活 性分别为;802D、;8;6、08O4、;80D4和08O2,而睾丸 组织则分别为;865、;84M、08OMM、08O46和08M5O。 由 此
6、可见骨髓和睾丸组织持续表达较高端粒酶活性, 虽然睾丸组织端粒酶活性随着年龄的增长呈下降趋 势,但下降的幅度较小,而骨髓组织端粒酶活性基本 保持稳定。 各年龄组间骨髓和睾丸组织端粒酶活性无 明显差别=PY0805C。与睾丸组织相比,除一月组骨髓组 织中端粒酶活性明显低于睾丸组织外=PZ0805C,其余 各年龄组两种组织中酶活性无显著性差异。=图;C 讨论 随着体细胞克隆技术和干细胞技术的巨大发 展,通过VC获得与受治疗患者相同遗传信息的胚胎 干细胞=-1/0niE I-1 E-66I,J9CIC,再利用J9CI分 化多潜能性得到移植治疗或组织工程所需的种子细 胞,从而避免了异体间移植所引发的免疫
7、排斥、病原 体的传播等问题。 因此VC将成为细胞移植治疗和组 织工程中最具应用前景的种子细胞来源;,2。 56; C MY K 中华神经医学杂志2005年6月 第4卷 第6期Chin J N-./01-23 J.n- 20054 506744 N08 6中华神经医学杂志2005年6月 第4卷 第6期Chin J N-./01-24 J.n- 20054 506 44 N08 6 由于9C研究起步晚,对于何种供体细胞最适合 用于9C, 尚缺乏依据和标准。 与动物克隆相比,9C 选择供体细胞的来源明显受取材限制。目前动物克隆 的研究表明,供体细胞选择与克隆有着密切关系:,;。 主要表现在:供体细胞
8、端粒长度决定克隆细胞的 端粒长度。 端粒位于线性染色体或染色质的末端,具 有保证线性?N完整复制、维持染色体结构稳定和 防止端粒?N降解的作用,同时与染色体定位及细 胞衰老密切相关=0。Ahi-6B等C发现克隆绵羊的端粒 长度比年龄相当的对照组短,而与其核供体细胞的端 粒长度相当,说明核供体细胞的端粒长度决定了其核 移植后代的端粒长度。供体细胞与克隆效率有关。 从目前动物克隆的结果分析,供体细胞的分化程度对 克隆效率影响较大,总体来看,核供体细胞的分化程 度越低,克隆效率越高,即DACBE胚胎成纤维细胞E 卵丘细胞E成纤维细胞=。 因此选择分化程度低的 细胞作为核供体,将有助于提高治疗性克隆效
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- 不同年龄 大鼠 组织 端粒 活性 变化 研究
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