东北梅花鹿初级卵母细胞的超微结构.pdf
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1、兽类学报,2006,26(1) :59 -63 Acta Theriologica Sinica 东北梅花鹿初级卵母细胞的超微结构 马泽芳1 张林媛2 郑丁团2 刘焕奇1 (1 山东莱阳农学院动物科技学院,莱阳, 265200) (2 东北林业大学野生动物资源学院,哈尔滨,150040) 摘要:研究东北梅花鹿初级卵母细胞发育的超微结构变化,目的是为探索东北梅花鹿初级卵母细胞的发育规律 提供组织学和形态学依据。本研究于 2003 年和 2004 年的6 月初到8 月末取3 只、9 月中旬到10 月初取4 只,共 计 7 只健康经产2 3 胎的成年东北梅花鹿卵巢;卵巢经2. 5%戊二醛固定液固定后
2、,切取约1mm3的卵巢皮质和 直径0. 5 1. 5 mm 及1. 5 3 mm 的卵泡作为电镜观察用材料;该材料经0. 1M pH7. 2 的 PBS 漂洗、1%锇酸固定、 不同浓度乙醇脱水后,再经 Epon812 和丙酮等量混合液浸透,最后用 Epon812 包埋制块,并用半薄切片机切成 0. 5 2 m 半薄切片;再经亚甲基兰 - 天青染色后,在光镜下进行卵泡分类和卵母细胞定位;将经定位的材 料用超薄切片机切成厚度为 700 800 的切片,经醋酸铀和柠檬酸铅双重染色后,用透射电镜观察、记录并照 相。观察时将卵泡依其直径大小、透明带的形成、卵泡腔的出现等分为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和
3、三级 卵泡 4 类。研究结果表明,在原始卵泡阶段,卵母细胞为较规则的圆形,质膜与卵泡细胞膜紧密相贴,有时形 成桥粒,细胞器多分布于近核区,高尔基体不典型,线粒体多为圆形,嵴较少;在次级卵泡阶段,2 4 层的卵 泡细胞局部开始形成透明带,4 层以上时形成薄的透明带,微绒毛斜伸入透明带内,方向不规律;在直径为 0. 5 1. 5 mm 的三级卵泡阶段,卵母细胞的透明带增厚,各种细胞器在皮质区内数量较多,皮质区内高尔基体的数 目增多,粗面内质网明显减少;在直径为 1. 5 3 mm 的三级卵泡阶段,卵母细胞的透明带继续加厚,微绒毛缩 短变弯,开始从透明带退出,许多皮质颗粒开始排列在卵母细胞膜下。 关
4、键词:东北梅花鹿;初级卵母细胞;发育;超微结构 中图分类号:R322. 2 文献标识码:A 文章编号:1000 -1050(2006)01 -0059 -05 Ultrastructure of the primary oocyte in Northeast sika deer(Cervus nip- pon hortulorum) MA Zefang1,ZHANG Linyuan2,ZHENG Dingtuan2,LIU Huanqi1 (1 Faculty of Animal Science and Veterinary Medicine,Laiyang Agricultural Coll
5、ege,Laiyang, 265200,China) (2 College of Wildlife Resources,Northeast Forestry University,Harbin,150040,China) Abstract:Seven 4 to 5 years old female Skia deer(Cervus nippon hortulorum)both in their reproductive and non-repro- ductive season were used to study the ultrastructural changes of the prim
6、ary oocytes during their development by using trans- mission electron microscopy. The ovarian tissues were treated according the requirement for the examination via electron mi- croscope. The follicles were divided into 4 groups according to their development. The results showed that at the primordi
7、al follicle stage,the oocyte was round and its plasma membrane closely adhered to the follicle cells,most organelles located were near the nucleus,the Golgi complex was not typical,and most mitochondria with fewer cristae were round. At primary and secondary follicle stage,follicles locally formed z
8、ona pellucida when they consisted of 2 to 4 layers of follicle cells,ir- regular microvili on the oocyte were present in the zona pellucida. At teriary follicle stage with a diameter of 0. 5 mm to 1. 5 mm,the zona pellucida became thick, the number of rough endoplasmic reticulum decreased obviously,
9、 and all kinds of or- ganelles and the Golgi complex increased number in the cortex. At the 1. 5 mm to 3 mm diameter follicle stage,the zona pellucida kept on increasing in its thickness,the microvili on oocyte became short and curving and started to withdraw from the zona pellucida,and a large numb
10、er of cortical granules began to laid beneath the plasma membrane of the oocyte. Key words:Development;Primary oocyte;Sika deer(Cervus nippon hortulorum) ;Ultrastructure 基金项目:黑龙江省归国青年留学基金资助项目(LC03C14) 作者简介:马泽芳(1962 - ) ,男,博士,教授,从事野生动物饲养与繁殖研究. E - mail:mazefang163. com 收稿日期:2005 -01 -14; 修回日期:2005 -0
11、8 -24 兽 类 学 报26 卷 梅花鹿(Cervus nippon)属于偶蹄目、鹿科的 反刍动物,在我国有 6 个亚种:东北亚种、华南亚 种、四川亚种、山西亚种、台湾亚种、河北亚种 (马泽芳,2000) ,各地所驯养的主要是东北亚种。 现在我国的野生梅花鹿主要分布在东北地区,特别 是长白山一带,但为数很少。 关于鹿卵母细胞发育的组织学方面的研究,在 国内,葛明玉(1982)对雌性梅花鹿生殖器官进 行了解剖学观测,方肇清等(1983)用组织学方 法对雌性东北马鹿生殖器官进行了研究,霍金富等 (1986)对雌性白唇鹿生殖器官进行了组织学研 究;在国外,山内昭二等(1981)对日本鹿卵巢 发育与
12、季节性变化进行了组织学研究,Asher 等 (1997)用超声波扫描对马鹿的有腔卵泡发育进行 了研究,Mcleod 等(2001)对马鹿有腔卵泡在卵 泡阶段的发育变化进行了研究。到目前为止,国内 外还没有对东北梅花鹿的初级卵母细胞发育的超微 结构进行研究。为此,本文采用电镜对东北梅花鹿 卵巢中初级卵母细胞的超微结构变化进行观察研 究,为探索东北梅花鹿初级卵母细胞的发育规律提 供组织学和形态学依据。 1 材料与方法 1. 1 材料 在吉林省双阳鹿乡镇,于 2003 年和 2004 年的 6 月初到 8 月末取 3 只,9 月中旬到 10 月初取 4 只,共计 7 只年龄 4 5 周岁、健康经产
13、2 3 胎的 成年东北梅花鹿卵巢。 1. 2 方法 1. 2. 1 电镜材料处理 将经颈动脉放血处死的东北梅花鹿卵巢尽快放 入平皿,立刻用刀片切成两半,迅速滴加少量冷的 2. 5%戊二醛固定液,再用新刀片和剪刀进行切取, 电镜取材的具体部位:1)取卵巢的皮质约1 mm3; 2)将直径 0. 5 1. 5 mm 和 1. 5 3 mm 左右的卵泡 分别从卵巢中切下。以上样品固定于 2. 5% 戊二醛 固定液中,并在 4保存。 1. 2. 2 电镜材料的制作 在 2. 5%戊二醛磷酸缓冲液中固定至少 24 h, 将卵巢皮质用双面刀片切成小块,用 0. 1M pH7. 2 的 PBS 漂洗 30 m
14、in(10 min/ 次)后,用 1% 锇酸 固定 1 2 h,再用0. 1M pH7. 2 的 PBS 漂洗30 min (10 min/ 次) ,然后用不同浓度乙 醇( 分 别 为 50%、60%、70%、80%、95%、100%) 脱水,用 Epon812 和丙酮等量混合液浸透 3 h,Epon812 浸 透 2 h,最后用 Epon812 包埋。修块后,用半薄切 片机切成 0. 5 2 m 半薄切片。经过亚甲基兰 天青染色后,在光镜下进行卵泡分类和卵母细胞 定位。定位修好的材料用超薄切片机切成厚度为 700 800 的切片。经醋酸铀和柠檬酸铅双重染色 后,用透射电镜观察、记录并照相。
15、1. 2. 3 卵泡的分类 在本实验中,将卵泡依其直径大小、透明带的 形成、卵泡腔的出现等分为以下 4 类:1)原始卵 泡:排列在卵巢皮质外周,由单层扁平的卵泡细胞 包围着卵母细胞;2)初级卵泡:单层立方卵泡细 胞包围着卵母细胞,卵泡膜尚未形成,也无卵泡 腔;3)次级卵泡:2 4 层卵泡细胞包裹卵母细 胞,卵泡细胞和卵母细胞的体积均较初级卵泡大, 透明带形成,包在卵母细胞周围,卵母细胞有微绒 毛伸入透明带内,但尚未形成卵泡腔;4)三级卵 泡:卵泡腔形成,并出现卵丘,同时形成颗粒细胞 层。 2 结果 2. 1 原始卵泡的卵母细胞 卵母细胞为较规则的圆形,由单层扁平的卵泡 细胞包围,表面光滑,卵母
16、细胞膜与卵泡细胞膜紧 密相贴,有的形成桥粒连接(图 1) 。 图 1 原始卵泡的卵母细胞 2000 Fig. 1 The oocytes of the primary follicle, 2000 细胞器多分布于近核区,高尔基体不典型,由 扁平囊和小泡组成,或以小管的形式分布于核周 区,分泌面朝向质膜。线粒体数量较多,在细胞质 中呈散在分布,多为圆形,嵴较少,呈板状,有的 线粒体没有嵴(图 2) 。粗面内质网丰富,与线粒 体相伴,表面有核糖体附着。胞质中还见有少量分 散的滑面内质网小泡,含有内容物的卵黄。一些类 06 1 期马泽芳等:东北梅花鹿初级卵母细胞的超微结构 似于皮质颗粒的圆形小体开始
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