人乳头瘤病毒16 E7限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的穿膜肽疫苗设计及体外免疫学研究.pdf
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1、临床皮肤科杂志2 0 0 5 年3 4 卷第1 2 期 J C l i n D e r m a t o l , D e c e m b e r 2 0 0 5 , V o 1 .3 4 , N o . 1 28 0 7 论 著 人乳头瘤病毒 1 6 E 7限制性细胞毒性丁淋巴细胞 表位的穿膜肤疫苗设计及体外免疫学研究 尹 锐, 都 飞, 都 进, 杨希川 ( 第三军医大学西南医院 皮肤科, 重庆 4 0 0 0 3 8 ) ! 摘 要目的: 利用穿膜肤人免疫缺陷病毒( H I V ) - T a t, , - 5, 的 穿膜能力, 设计穿膜肤人乳头瘤病毒( H P V ) 1 6 E 7 限制
2、性细胞毒 性T 淋巴细胞( C T L ) 表位( 第4 95 7 位氨基酸) 的融合肤疫苗, 并在体外研究其诱导特异性C T L 的应答能力。 方法: 应用多肤固 相合成技术, 分别合成含H I V T a t 、 和人类白 细胞抗原( H L A ) - A 2 . 1 限制性C T L 优势表位H P V 1 6 E 7 a ,_ 5 , 的1 8 肤, 和该C T L 表 位的9 肤, 并用一无关肤作对照, 在体外用乳酸脱氢酶( L D H ) 细胞毒性试验分别检测了上述1 8 肤和9 肤在H L A - A 2 阳 性健康 者外周血单个核细胞( P B M C ) 中 诱导的 表位E
3、 7 4 9 - 57 的 特异性C T L 活性。 结果: 经质谱分析, 上述多肤成功合成, 纯度均在9 5 % 以 上。 与9 肤相比, 1 8 肤能在体外诱导出明 显 增强的 特异性C T L 活 性( P 0 .0 5 ) 。 3 讨论 有报道,目 前H P V感染的发病率呈逐年上升并 有年轻化的趋势。 高危型H P V 1 6 是感染后引起阴道、 宫颈尖锐湿庆并最终导致阴道癌、 宫颈癌的最常见型 别, 与各级上皮瘤及侵袭性鳞状细胞癌均有关。E 7 蛋 白 是H P V相关肿瘤特异性肿瘤排斥抗原, 具有良 好 的免疫学特性, 而且基因序列保守, 是诱导和维持癌 细胞恶性表型的必需蛋白,
4、 在大多数宫颈癌及癌前期 病变中 均持续广泛表达, 而 在正常 组织中 不表达。 因 此 成为研究抗H P V相关感染及其相关肿瘤疫苗的靶 标121 。 但多肤疫苗的 免疫原性通常较低, 且难以 被A P C 捕获、 加工并提呈, 不能有效激发C T L 活性。 可见如何 有效诱导抗原特异性C T L 介导的细胞免疫, 已 成为多 肤疫苗研制中函待解决的问题。 故探索一种使多肤抗 原高效地进人A P C 胞质, 进而循M H C - I 类抗原提呈 途径提呈的安全传递系统, 无疑对于多肤疫苗的研制 有重要意义。 近来研究发现, 穿膜肤( c e l l - p e n e t r a t i
5、n g p e p t i d e s , UP ) 可有效携带多肤、 蛋白质、 D N A甚至颗粒性物质 等, 通过受体依赖或非依赖、 无耗能的 方式, 迅速穿过 哺乳动物活细胞的质膜进人细胞质, 并在一定浓度范 围内对细胞无任何毒副作用口 。这是一类长度为数个 至数十个氨基酸不等的蛋白质, 现已有多种蛋白质来 源的UP S 得到证实, 其中包括H I V - 1 的T a t 蛋白, 它 是H I V - 1 的转录活化因子, 其碱性区( 第4 95 7 位氨 基酸) 对实现细胞内在化起着关键作用, 利用该片断 可将其他蛋白质有效地导人活细胞内。 但在C T L 表位的 肤疫苗分子 设计中
6、, 需要考虑侧 翼 序列对C T L 表位的 提呈, 位于C T L 表位的 梭基末端 ( C 末端) 会显著影响表位的提呈, 而位于氨基末端( N 末端) 则不影响或仅产生微弱的影响问。 以 往研究证实, T a t4 9 5 7 无论位于 蛋白 的N 末端或C 末端, 均具有穿膜 活性, 故本研究中, 在设计多肤序列时, 将T a t 4 9 5 7 置于 C T L 表位的N末端, 保留原C T L 表位的游离 C 末端。 采 用固 相多肤合成技术, 合成了 含T a t 4 9 -5 7 和E 7 4 9 -5 7 表位的 1 8 个氨 基酸残基的 多肤, 同 时 合成一个仅含有单纯表
7、 位的9 肤, 经纯化后质谱分析, 纯度在9 5 % 以 上, 已 能 满 足后续实验的 要求。 本实验中采用T 2 细胞作为体外C T L 试验的靶细 胞, 是因为T 2 细胞为H L A - A * 0 2 0 1 + 人淋巴瘤细胞, 缺 乏内源性抗原加工处理能力, 通常情况下其表面空载 的H L A - A 2 分子 仅有少量表达 且极不 稳定, 表达 后很 快降解。 抗原肤与之结合后, 可以稳定其表达, 抗原肤 与H L A - A 2 的结合力越强, 则T 2 细胞表面H L A - A 2 分子的表达量就越高6- 71 。 本实验中选用一无关肤作为 对照, 以健康人P B M C
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