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1、!研究简报! 收稿日期“ ! “ “ # ! “ % ! “# 修回日期“! “ “ # ! $ “ ! ! # 作者单位“ $“ ! ! “ “ !江苏淮安市第二人民医院 徐州医 学院附属淮安医院肿瘤外科! !“淮阴师范学院生物系!“第 二军医大学东方肝胆外科医院病毒与基因治疗研究室 作者简介“ 黄选东“$ ) * ! !# $ 男$ 本科$ 副主任医师$ 主要 从事乳腺外科工作 人内皮抑素基因腺病毒表达载体的构建及其在 乳腺癌细胞中的表达活性 黄选东$ 周雪瑞!$ 苏长青$ 张晓雨$ 于爱茸! 关键词“ 内皮抑素! 腺病毒! 基因治疗! 抗血管治疗! 乳腺癌 中图分类号“D ( (“ )#
2、D ( ! * .!文献标识码“ /!文章编号“$ “ “ “ ! % # ( %$ ! “ “ *%“ ! “ ! “ ! ! “ ! D!引言 近年来! 阻止肿瘤血管生成! 控制肿瘤的生长和 转移! 成为肿瘤治疗的一项新策略“ $!#! 其中采用转 染血管生成抑制剂拮抗血管的生成! 以内皮抑素最 为理想“ #$本文通过构建人内皮抑素基因的腺病毒 表达载体! 研究内皮抑素在乳腺癌细胞中的表达! 为 进一步研究乳腺癌的抗血管基因治疗做好准备$ E!材料与方法 $“ $!材料 携带人内皮抑素基因%* H 0 (9 ( ? + 4 = 0 = 3 (!* C . / E A 9 E4 E 3 (
3、H 3 ( 3 E A 9 E N 3 =(; . / 0 H E J %/ K F + + ? I 3 ( 3U 3 =购 自 ; . /6 C %公 司I ! M C D I 0 HH 0 F 3 0 ( M A + = 9 3 ( C G ! = A 0 B = 3 + (D 9 0 , 9 ( =购自M . C D O C公司P 9 4 = 9 A (显色 液2 H 3 6 2 5B * 9 H 3 F H 3 ( 9 4 B 9 ( = A 9 0 , 9 ( =0 ( ?E 9 A + G ! 3 ? 9为O 9 F F# 3 , ( 0 F 3 ( , 9 B * ( + F +
4、 , 1公司产品 鼠抗人 * C单克隆 抗体(R . O标 记 的 羊 抗 鼠. , 6抗 体( 7D M标记的羊抗鼠. , 6抗体购自武汉博士德公司 携带报告基因2 0 B :的增殖缺陷型腺病毒/ ? ! 2 0 B : 由东方肝胆外科医院病毒与基因治疗研究室保存$ $“ !腺病毒载体质粒 E / ? ! * C的构建 根据6 9 ( K 0 ( N/ R $ % . / 0 H EJ % /K F + + ?I 3 ( 3U 3 =提取腺病毒 J % /! 应用引物M $和M !进行M O D鉴定$鉴定正确 者命名为/ ? ! * C$采用! ) 细胞进行病毒的扩增! 以 氯化铯梯度离心进
5、行病毒纯化! 测定病毒滴度$ $“ &!免疫荧光和免疫印迹检测* C 在乳腺癌细胞 中的表达 在*孔板上接种人乳腺癌细胞株IK J ! ! $和 IO R ! (!$/$ “ &个细胞+孔! 以重复感染度% I5 .& 为 $ “的感染强度! 感染重组病毒/ ? ! * C$继续培养 & % *后! 收集细胞$取少量细胞悬液滴在玻片上! 进 行免疫荧光标记! 荧光显微镜下观察* C的表达$ 其余细胞以I ! M C D I 0 HH 0 F 3 0 (M A + = 9 3 (C G = A 0 B = 3 + ( D 9 0 , 9 ( =裂解后回收蛋白! 在$ “Q聚丙烯酰胺凝胶 中( “
6、 Y恒压电泳! 分离蛋白质! Y!) “ H/条件下用 电转移仪将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上! 进行 P 9 4 = 9 A (K F + =检测$ $“ #!重组腺病毒表达* C的活性鉴定 以C O Y “ &为靶细胞! 接种至*孔板中培养! $ /$ “ #个细胞+孔! 培养! & *$以 I5 .-$ “ “($ “($( “ $(“ “ $(“分别感染重组腺病毒/ ? ! * C或/ ? ! , !“! ,肿瘤防治研究! “ “ *年第 卷第期 2 0 B :后继续培养! 在病毒感染后第 ?!用$ “Q结 晶紫福尔马林溶液固定$ “ H 3 (! 龙胆紫染色“ F!结果 !“ $!腺病
7、毒载体质粒 E / ? ! * C及重组腺病毒/ ? ! * C的鉴定!见图$ /!$ K 图E !腺病毒载体质粒O ! % 5 3 N及重组腺病毒! % 5 3 N的鉴定 /#质 粒C B + D - 0 .双 酶 切!$E O / $ $!E / ? ! * C$ 2 0 H ? 0J %/%C B + D . .7 3 ( ? . . .“K# 重组病毒M O D扩增!$ $ “ “ EJ %/ 2 0 ? ? 9 A$!/ ? ! * C$阴性对照$&E K F 0 4 = ! * C ( ! ? + 4 = 0 = 3 (阳性对照“ !“ !基因表达的鉴定 乳腺癌细胞株IK J !
8、! $和IO R ! (以I5 .- $ “感染重组病毒/ ? ! * C后! 进行免疫荧光标记! 荧 光显微镜下观察* C的表达“结果发现IK J ! ! $ 和IO R ! (细 胞 株 阳 性 表达* C的百分比分别为 & * (“ +$ !“ #Q和& *“ %+$ #“ *Q! 见图! /(! K“ 图F!3 N基因表达的鉴定 /# 免疫荧光标记显示IK J ! ! $细胞感染/ ? ! * C后* C表 达明显“K#P 9 4 = 9 A (K F + =显 示 乳 腺 癌 细 胞IK J ! ! $和 IO R ! (感染/ ? ! * C后* C表达阳性! 阳性程度高于$ “
9、“( , 标准对照! 而无病毒细胞培养上清阴性“ !“ !重组腺病毒表达* C的活性 C O Y “ &以 不 同 的I5 .值 感 染 重 组 腺 病 毒 / ? ! * C后! 随I5 .的增高!C O Y “ &的生长被明显 抑制! 而同时感染对照腺病毒/ ? ! 2 0 B :的细胞的生 长不受影响! 见图“ 图G!重组腺病毒! % 5 3 N表达3 N的活性 G!讨论 内皮抑素是胶原$ %的降解产物! 降解过程至少 包括两步酶解! 参与酶解的可能有弹性蛋白酶( 组织 蛋白酶2和基质金属蛋白酶) &*“内皮抑素能特异 性抑制血管内皮细胞在Y C 6 R( R 6 R等诱导下的 增殖!
10、抑制内皮细胞的迁移! 诱导内皮细胞凋亡! 但 对非内皮细胞! 如平滑肌细胞( 成纤维细胞等均无抑 制作用) #*“内皮抑素这一特点! 为抗血管生成的肿 瘤基因治疗策略开辟了道路“通过载体转导内皮抑 素基因使其在体内长期( 稳定表达生物活性高的内 皮抑素! 这种方法从蛋白质水平转移到基因水平! 具 有生产简便! 在体内表达产物的生物学活性高! 可长 期表达! 有效弥补蛋白治疗的不足! 同时降低成本! 使患者容易接受) *“相对非病毒载体! 应用病毒载 体转染后可获得更高的内皮抑素血浆浓度“ 本文成功构建了携带人内皮抑素基因的腺病毒 载体“实验证实! 该增殖缺陷型腺病毒能够介导内 皮抑素基因在人乳
11、腺癌细胞系中高效表达! 其表达 的内皮抑素具有显著抑制血管内皮细胞生长的活 性! 在I5 . -$ “时! 已经能够完全抑制血管内皮细 胞系C O Y “ &的生长“这一基因治疗载体病毒的 构建与重组! 为乳腺癌及其他肿瘤的治疗提供了一 个有用的方法和思路“抑制肿瘤相关新生血管生 成! 可以控制肿瘤生长“目前! 内皮抑素已进入临床 试验! 前景广阔) (*“我们在这一领域将进行更深入 的研究“ 参考文献! )$*!J * 0 ( 0 0 FI!& 9 8 8 9 A 4I!2 0 A + B * 9 F F 9P & “ / ( = 3 ! 0 ( , 3 + , 9 ( 3 B = * 9
12、A ! 0 E 10 4 0 B 0 ( B 9 A = A 9 0 = H 9 ( = E 0 A 0 ? 3 , H)&*“ O A AI 9 ?O * 9 H/ ( = 3 ! O 0 ( B/ , 9 ( = 4! “ “ #!#&! #$ $ # ! $ “ )!*!M + A2!7 0 X 9 ND!K B * F 9 A!9 = 0 F “/ ( , 3 + , 9 ( 9 4 3 40 ( ?0 ( = 3 0 ( ! , 3 + , 9 ( 3 BB 0 ( B 9 A= * 9 A 0 E 1)&*“Y ( 3 = A2 9 N! “ “ &!# “&$ ! #) “ !
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