人参炔醇对大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用及机制.pdf
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1、人参炔醇对大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用及机制 蒋丽萍1, 2, 聂宝明1, 卢慧敏2, 干丽君2, 陈红专1, 陆 阳1 (1. 上海第二医科大学药物研究所, 上海 200025; 2. 江西医学院药理学教研室, 江西 南昌 330006) 收稿日期: 2005 -06 -06, 修回日期: 2005 -08 -30 基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (No 30371731) ; 上海第二医 科大学基金项目 (No 2003HZJJ0020) 作者简介: 蒋丽萍 (1965 - ) , 女, 博士生, 副教授, 研究方向: 心血管 分子药理学, E-mail: lipingjian
2、g2002 Yahoo. com. cn; 陆 阳 (1955 - ) , 男, 教授, 博士生导师, 研究方向: 中药 药理学, Tel: 021-63846590-776464, E-mail: huaxue shs- mu. edu. cn 中国图书分类号: R-332; R 282. 71; R 284. 1; R 322. 74; R 329. 2; R 329. 25; R 543. 505. 3 文献标识码: A 文章编号: 1001 -1978 (2005) 11 -1313 -07 摘要: 目的 观察人参炔醇 (panaxynol, PNN) 对大鼠主动脉 平滑肌细胞 (RA
3、SMC) 增殖的抑制作用及机制。方法 由细 胞计数、3HTdR 参入试验确定细胞增殖率, 采用分子探针 Fura-3/ AM 及 共 聚 焦 显 微 镜 检 测 胞 内 游 离 Ca2 +浓 度 ( Ca2 + i ) , RT-PCR 方法观察线粒体转录因子 1 ( mtTF1) mRNA 的表达。结果 PNN 以浓度依赖方式抑制血清及 PDGF-BB 诱导的 RASMC 增殖和 DNA 合成; 9 molL -1 PNN 预处理 RASMC 能抑制 PDGF-BB 引起的 Ca2 + i 升高; PDGF-BB 上调 RASMC mtTF1 mRNA 表达, 该作用可被 3、 9 molL
4、 -1 的 PNN 抑制。结论 PNN 具有抗 RASMC 增 殖作用, 该作用与降低 Ca2 + i 和抑制 mtTF1 mRNA 表达有关。 关键词: 人参炔醇; 大鼠主动脉平滑肌细胞; 细胞增殖; PDGF-BB; 胞内游离 Ca2 +浓度; 线粒体转录因子 1 病理状态下, 血管平滑肌细胞 (vascular smooth muscle cells,VSMC) 由收缩型转变为合成型后, 迁 移至内膜, 大量增殖和分泌细胞外基质, 由此导致血 管增生重构, 这是许多心血管疾病的重要病理变 化 1, 2。研究 VSMC 的异常增殖机制, 通过不同方 式阻断其增殖途径是心血管疾病治疗的策略之
5、一。 从中草药中寻找抑制 VSMC 增殖有效成分, 研究其 对血管增生性疾病的防治作用, 是我国医药学界研 究的重点之一。 实验观察表明血小板衍生生长因子 (platelet- derived growth factor, PDGF) 和血清均可刺激 VSMC 增殖。PDGF 是强促有丝分裂原, 具有 PDGF-AA、 PDGF-BB、 PDGF-AB 3 种二聚体结构, 其中 PDGF- BB 对 VSMC 迁移和增殖、 促进新内膜形成起重要作 用。PDGF 促 VSMC 增殖的作用被认为是由 MAPK、 PKC、 早期生长反应基因和 Ca2 +等多条细胞内信号 通路介导的。血清是复合型的营
6、养物质, 其促 VSMC 增殖作用主要取决于其含有的 PDGF, 碱性成 纤维细胞生长因子 (basic fibroblast growth factor, bF- GF) 等生长因子。有文献 3报道损伤大鼠动脉 VSMC 增殖依赖于线粒体转录因子 1 (mitochondrial transcription factor 1, mtTF1, mtTFA) 表达的上调, 生 长激素促进 VSMC 增殖加速动脉粥样硬化的早期发 展也与 mtTF1 表达上调相一致 4。 三七 (Panax notoginseng) 为常用的传统中药, 其味甘、 微苦, 性温, 具有散淤止血、 消肿止痛等功 效,
7、用于治疗跌打损伤和各种出血性疾病。三七中 含有多种有效成分, 我们首次从三七的脂溶性部位 分离 得 到 生 物 活 性 炔 醇-人 参 炔 醇 ( panaxynol, PNN) 5。研究表明, PNN 可通过抑制 Ang引起的 大鼠主动脉收缩反应发挥降压作用 6, PNN 能通过 抑制血小板聚集、 ATP 释放及血栓噁烷形成 7以及 通过抑制 HMG-CoA 还原酶等作用预防动脉粥样硬 化 8, 9, PNN 对 肿 瘤 细 胞 增 殖 有 明 显 的 抑 制 作 用 10。PNN 作为主要作用于心血管系统中药三七 的活性成分之一, 同时又具有抗肿瘤细胞增殖等作 用, 这一事实促使我们开展
8、PNN 抗 VSMC 增殖作用 的研究。本文报道 PNN 抗血清和 PDGF-BB 刺激原 代培养大鼠主动脉平滑肌细胞 (rat aortic smooth muscle cells, RASMC)增殖的作用及其对 PDGF 诱 导的 Ca2 + i 和 mtTF1 mRNA 表达的影响。开展 PNN 抗 VSMC 增殖作用及其机制的研究将有助于 阐明中药三七活性作用的物质基础及 PNN 在心血 管疾病治疗中可能发挥的各种活性作用。 1 材料与方法 1. 1 实验动物 +8 10 wk 龄 Sprague-Dawley 大 鼠, 由上海第二医科大学实验动物科学部提供。 1. 2 实验药品及仪器
9、 PNN 由本研究所从三七根 中分离和纯化 5, 纯度 98%。PNN 溶液由含 25 g L -1 PNN 的二甲基亚砜 (DMSO) 溶液用培养液稀 释至终浓度, 4 保存备用。PDGF-BB、 DMSO 为美 国 Sigma 公司产品; DMEM 培养基为美国 Gibco 公 司产品; 胎牛血清 (FBS) 为杭州四季青生物材料有 限公司产品; -actin 试剂盒为美国 Santcruz 公司产 3131中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Nov; 21 (11) : 1313 9 品;3Hthymidine ( 3H -TdR)
10、 为中科院上海原子 能研究所产品; Fura-3/ AM 为美国分子探针公司产 品; 总 RNA 提取试剂盒为北京华美生物工程公司产 品; M-MLV、 RNasin、 随机引物、 Taq 酶为美国 Pro- mega 生物试剂公司产品; 其他试剂均为国产分析 纯。水套 CO2培养箱 (Forma 公司, 美国) ; IX70 荧 光倒置相差显微镜 (Olympus 公司, 日本) ; 激光共聚 焦显微镜 (Zeiss LSM-510, 德国) ; 液体闪烁计数仪 (Wallac 公司, 芬兰) ; CX7Delta 生化仪 (Beckman, 美 国) 。 1. 3 RASMC 原代培养及鉴
11、定 11 采用组织块种 植法进行 RASMC 原代培养。无菌条件下取出大鼠 胸主动脉, Hanks 液洗涤, 剪成 2. 5 3. 0 cm 的血管 段, 放入10% FBS DMEM 培养液 (含1 105UL -1 青霉 素,100 mg L -1 链 霉 素,25 mmol L -1 HEPES) , 剥离外膜, 将动脉纵行剪开, 刮去内膜, 剪 成 1 mm3左右的组织块, 移入培养瓶, 于 37孵箱 静置培养。每 3 天更换 1 次培养液, 待细胞生长融 合出现 “ 峰与谷”结构, 用 0. 05% 胰蛋白酶 ( 含 0. 02% EDTA-Na2) 消化, 首次传代按1 : 1,
12、以后隔3 5 d 按1 : 3 传代。经形态学和免疫细胞化学法鉴 定为平滑肌细胞, 实验用第 3 11 代细胞。 1. 4 PNN 对血清刺激 RASMC 增殖的影响 1. 4. 1 RASMC 计数 取生长稳定 80% 90% 融 合的 RASMC, 消化后以相同密度接种于 24 孔培养 板, 5 104/ 孔, 1 ml/ 孔, 37 培养 24 h。更换含 0. 5% FBS 的 DMEM 培养液, 培养 48 h, 细胞同步 化。细胞分为: 对照组 (control, 含 0. 1% DMSO) , 0. 3、 1、 3、 9、 27 molL -1 5 个 PNN 组, 每组 3 个
13、复 孔。各组均用 10% FBS DMEM 培养液配制。加药 后孵育 72 h, 终止反应, 胎盼蓝 (trypan blue) 染色, 活细胞计数。实验重复 3 次。 1. 4. 2 3H -TdR 参入法测定 RASMC DNA 合 成 12 RASMC 接种于 96 孔板, 1. 5 104/ 孔, 100 l/ 孔, 37培养 24 h。同步化及分组同上, 每组 5 个复孔。孵育 68 h, 每孔加入 3. 7 104Bq 3H - TdR, 继续培养 4 h, 弃培养液终止反应; 每孔加 100 l 0. 1 molL -1 NaOH 溶解细胞, 将细胞收集到玻 璃纤维滤膜上, 蒸馏
14、水反复冲洗; 液体闪烁计数仪测 定各样本的 3Hmin 放射脉冲数 (CPM) 。实验重 复 4 次。 1. 5 PNN 对 PDGF-BB 诱导 RASMC 增殖的影响 1. 5. 1 PNN 对 PDGF-BB 诱导 RASMC 计数的影响 实验方法同 1. 4. 1。细胞分为对照组, 50 g L -1 PDGF-BB 组, 0. 3、 1、 3、 9、 27 molL -1 PNN 组 (均含有50 gL -1 PDGF-BB) 。对照组、 PDGF-BB 及各浓度 PNN 组用 DMEM 配制, PNN 预处理1 h 后 加入 PDGF-BB。 1. 5. 2 PNN 对 PDGF-
15、BB 诱导 3H -TdR 参入的影 响 细胞分组同 1. 5. 1, 实验方法同 1. 4. 2。 1. 6 PNN 对 RASMC 计数时效关系的影响 实验 方法同 1. 4. 1。细胞分对照组 (10% FBS DMEM 培 养液配制) , 9 molL -1 PNN 组 (配制同对照组) , 50 gL -1 PDGF-BB 组 (DMEM 配制) , 9 mol L -1 PNN (DMEM 配制)+50 gL -1 PDGF-BB 组, 每组 3 个复孔。分别于孵育 24、 48、 72 h 终止反应, 胎盼蓝染色, 活细胞计数。实验重复 3 次。 1. 7 胞内游离 Ca2 +浓
16、度 ( Ca2 + i) 测定 按文 献 13采 用 激 光 共 聚 焦 显 微 镜( confocal)观 察 RASMC Ca2 + i 。RASMC 以 2 107L -1接种于 6 孔板, 当 30% 40% 细胞融合时, 更换成含 0. 5% FBS 的 DMEM 培养液, 培养 48 h, 使细胞同步化。 细胞分为对照组, PDGF-BB 组, PNN + PDGF-BB 组, 每组 3 个复孔。9 molL -1 PNN 孵育 24 h 后, 各 组用 10 mgL -1 Fura-3/ AM 负载 30 min, PBS 冲 洗, 加入 50 gL -1 PDGF-BB 作用
17、7 min, confocal 观察 7min 内 RASMC Ca2 + i 荧光强度的动态变 化。 1. 8 RT-PCR 测 定 mtTF1 mRNA 表 达 4 RASMC 以 5 108L -1 接种于培养皿, 37 5% CO2培养 24 h, 当 80% 90% 细胞融合时进行同步 化 (方法同前) 。细胞分为对照组, 50 g L -1 PDGF-BB 组, U0126 (10 molL -1)+ PDGF-BB (50 gL -1) 组, 1、 3、 9 molL-1 PNN 组 (均含 50 g L -1 PDGF-BB) 。U0126 及 PNN 组孵育 24 h 后加
18、入 50 gL -1 PDGF-BB, 继续孵育 6 h, 提取细胞总 RNA。核酸蛋白质分析仪测定 OD260/ OD280值在 1. 8 2. 0 之间, 说明总 RNA 纯度较好。总 RNA 浓度 (mgL -1)= K OD 260值 稀释倍数 (K =40) 。经 逆转录, cDNA 合成完毕, -20保存备用。 PCR 引物序列如下: mtTF1 (579bp) 正义: CTC GCC TGT CAG CCT TAT,反义: TCA GCC ATT TGC TCT TCC。-actin 引物序列 (157 bp) : 正义: GAG GGA AAT CGT GCG TGA,反义:
19、GCA TCG GAA CCG CTC ATT。用 -actin 作为内参照, 阴性对照用 总 RNA 代替 cDNA 进行扩增。扩增反应条件: 95 预变性 5 min, 9 个循环 (94变性30 s, 53退火80 s, 72延伸40 s) , 25 个循环 (94变性30 s, 53退 火 40 s, 72延伸 40 s) , 72 终延伸 5 min。取 10 l 扩增产物, 与加样缓冲液混合, 1. 7% 琼脂糖凝胶 4131中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Nov; 21 (11) 电泳, 0. 5 TBE 电泳缓冲液,
20、120 V 电泳 30 min, 紫 外透射仪观察电泳结果, 凝胶成像处理系统处理结 果。 1.9 LDH 活性测定 RASMC 以 1. 5 104/ 孔接种 于 96 孔板, 100 l/ 孔, 同步化及分组同 1. 4. 1; 孵育 72 h, 取 100 l 细胞培养上清液, 按 LDH 测试盒说 明书操作, 测定反应 300 s 时 340nm 的吸光度 (A) , 计算 LDH 活力。 1. 10 统计学处理 本实验所有数据均采用*x s 表示, 组间差异采用方差分析、 Student-Newman- Keuls (SNK) 检验和 t 检验。 2 结果 2. 1 PNN 对血清刺
21、激 RASMC 增殖的影响 因 PNN 溶液由含25 gL -1 PNN 的 DMSO 溶液用培养 液稀释至终浓度, 所以先对 0. 1% DMSO (用培养液 配制) 的作用与培养液进行比较。发现 0. 1% DM- SO 的 RASMC 数量与对照组差异无显著性 (数据未 显示) , 表明该浓度 DMSO 不影响细胞增殖, 因此以 下实验的对照组含 0. 1% DMSO。 1 27 molL -1 PNN 与 RASMC 共同孵育 72 h, 能浓度依赖性地降低其数量 (见 Fig 1A) , IC50= 6. 2 molL -1。此抑制作用与对照组相比, 差异有 显著性。通常情况下, 药
22、物的浓度与效应呈对称 S 型关系, 当药物达到一定浓度, 其效应达峰值。图中 显示 9 molL -1的 PNN 对 RASMC 增殖的抑制效 应已接近最大。 PNN 对 3HTdR 参入的影响与对细胞计数的 影响相似。1 27 molL -1 PNN 与 RASMC 共同 孵育 72 h, 能浓度依赖性地抑制 3HTdR 参入 RASMC (见 Fig 1B) , 与对照组相比, 差异有显著性。 且 9 molL -1的 PNN 的抑制作用已接近效应峰 值。表明 PNN 能明显抑制血清刺激诱导的 RASMC 的 DNA 合成速率提高。 2. 2 PNN 对 PDGF-BB 诱导 RASMC
23、增殖的影响 除观察 PNN 对血清刺激 RASMC 增殖的影响外, 我们还观察了 PNN 对 50 gL -1 PDGF-BB 诱导 RASMC 计数的影响 (见 Fig 2A) 。RASMC 与 50 g L -1 PDGF-BB 孵育 72 h,其数量明显上升。除 0. 3 molL -1, 不同浓度 PNN 预处理均能抑制 PDGF-BB 诱导的细胞数增加。同样, 9 molL -1 PNN 的抑制作用已接近最大。PNN 降低血清刺激 RASMC 数量及对 PDGF-BB 促分裂效应的抑制提示 其能有效抑制 RASMC 增殖。 PNN 对 PDGF-BB 诱导 3H -TdR 参入的影响
24、 结果 (见 Fig 2B) , 50 gL -1 PDGF-BB 能使 3H CPM 升高, 表明 PDGF-BB 强烈诱导 DNA 合成。1 27 molL -1 PNN 预处理能抑制 PDGF-BB 诱导的 CPM 的增加。PNN 对血清及对 PDGF-BB 诱导的 DNA 合成的抑制亦提示其能有效抑制 RASMC 增 殖。 Fig 1 Effect of different concentrations of PNN on the number of RASMC (A) ,and on incorporation of3H -TdR into RASMC (B) ,the incuba
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- 人参 大鼠 主动脉 平滑肌 细胞 增殖 抑制 作用 机制
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