免疫磁珠分离涂片和PCR检测痰内结核分枝杆菌的诊断价值研究.pdf
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1、1 4 江苏预防医学2 0 1 0 年3 月第2 1 卷第2 期J i a n g s uJP r e vM e d ,M a r c h ,2 0 1 0 ,V o L2 1 ,N o 2 积极防治心脑血管疾病是慢性病防治工作中的重要内 容。大量研究显示,糖尿病与心脑血管疾病的共同危 险因素是高血压、高血脂、高血糖、肥胖、吸烟、饮酒、不 良的生活方式等。李光伟认为高血压与糖尿病在流行 病学上的联系并非偶然,两者在病因学上有着许多共 同的基础 3 。最有力的证据莫过于肥胖,无论是遗传 因素还是环境因素引起的肥胖都能促成高血压和糖尿 病。本研究还发现,糖尿病与心脑血管疾病男性初期 死亡率均明显低
2、于女性,但糖尿病与脑血管疾病上升 幅度却明显大于女性,而心血管疾病死亡率男女上升 幅度相当。另外,近年来海门市女性糖尿病与心血管 疾病的死亡率明显高于男性,可能与女性特殊的生理 特点( 如雌激素的变化等) 有关。临床研究为女性心血 管病预防指南的制订提供了证据,国外学者以循证医 学为基础,制订了第一个针对女性群体的心血管病预 防指南。该指南对女性心血管病预防提出专门的指导 建议,在心血管病危险分层的标准、心血管病预防和治 疗的标准上均针对女性,包括生活方式干预、主要危险 因素干预、预防用药干预、心房颤动脑卒中预防和 C L A S S I 干预措施 引。由此看来,同时开展糖尿病、 心血管疾病和
3、脑血管疾病的防治,针对共同的危险因 素采取措施,对有效降低上述三种疾病的发病率和死 亡率显得尤为重要,有待于流行病学工作者和心脑血 管疾病以及相关学科领域的专家共同努力,以达到预 防上述疾病的目的。 参考文献 E l l B L m eJ B ,G i l l s b e I 謦H N ,妯sG L 。e ta LP 而瑚r yP T e v e n t i o nO fc a , d i o v a s c u h rd i 鼬a 蛸i nP a ew i t hC t e sm e 儿i t L i S :As d e a t i f i cs t a t e - n v ,1 tf r
4、o mt h eA m 谢c 锄h e a r ta s s o c i a t i o na n dt h eA m 幽t nd i a b e t e a a s s o d a d ( m D D i a b e t e ac a l ,2 0 0 7 ,3 0 :1 6 2 - 1 7 2 2 项坤三。贾伟平,陆俊茜,等中国上海地区4 0 岁以上成人中肥胖 与代谢综合征的关系 J 中华内科杂志,2 0 0 0 ,3 9 ( 4 ) :2 2 4 2 2 8 3 李光伟高血压与糖尿病一代谢综合征的两柄利剑F J 高血压 杂志,2 0 0 3 ,1 1 ( 1 ) :3 - 4 4 B a
5、 i e r yM N ,B o n o wR O ,S o P k o G ,e ta LC u r r e n ts t a t u sa n df u t u r er e s e a r c hd i r e c t i o n sr e P o r to ft h eN a t i o n a lH e a r t ,L u n ga n d B l o o dI n s t i t u t eW o r k s h o PO c t o b e r2 - 4 ,2 0 0 2E x e c u t i v eS u m m a r y ( A H A N H L B IC o n
6、f e r e n c eP r o c e e d i n g s ) 刀C i r c u l a t i o n ,2 0 0 4 , 1 0 9 :8 0 5 8 0 7 论著 免疫磁珠分离涂片和P C R 检测痰内结核 分枝杆菌的诊断价值研究 郑玉群1 ,许卫国2 ,陆伟2 ,焦永军2 ,肖占沛1 ( 1 东南大学公共卫生学院,江苏南京2 1 0 0 0 9 ;2 江苏省疾病预防控制中心,江苏南京2 1 0 0 0 9 ) 【摘要】目的:探讨免疫磁珠分离涂片染色镜检法和免疫磁珠分离一P C R 法对痰标本中结核分枝杆菌的诊断价值。 方法:利用纯化的兔抗H 3 7 R v 血清包被磁珠
7、,对痰中结核分枝杆菌进行分离,再进行涂片和P C R 检测。结果:免疫磁珠分离 涂片法比直接涂片法( P = 4 0 8 3 ,P = 0 0 3 9 ) 、免疫磁珠分离一P C R 法比常规P C R ( 矛= 2 3 3 1 ,P O 0 1 ) 的灵敏度高。结论: 免疫磁珠分离涂片法和磁珠分离一P C R 法因操作简单、阳性率高,适宜在临床上推广使用。 【关键词】免疫磁珠分离;痰;结核分枝杆菌;涂片;聚合酶链反应 【中图分类号】R 一3 3 1【文献标识码】A【文章编号】1 0 0 6 - - 9 0 7 0 ( 2 0 1 0 ) 0 2 - - 0 0 1 4 - - 0 4 T h
8、 ed i a g n o s i sv a l l l eo fi m m u n o m a g n e t i cb e a ds e p a r a t i o no fm y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i sf r o ms p u t u mf o rs m e a r a n dp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n Z H E N G 汽掣挖,X U 眈i g 加,L U W e i ,J I A O Y o n g - - j 姗,X I A O Z h a n - - p
9、 e i ( C o l l e g eo fP u b l i cH e a l t h ,S o u t h e a s tU n i v e r s i t y 。N a = j i n g2 1 0 0 0 9 ,C h i n a ) A b s t r a c t O b j e c t i v e :T oi n v e s t i g a t et h ea p p l i c a t i o nv a l u eo fI M S - - s m e a ra n t i - - a c i ds t a i n i n gm e t h o da n dI M S - - P
10、 C Rt e c h n i q u e M e t h o d s :T h ea n t i H 3 7 R vi m m u n o s e r u m sw e r ei m m o b i l i z e do nt h es u r f a c eo ft h ea c t i v em a g n e t i cb e a d s 。w h i c hp r o - D o I :1 0 3 9 6 9 j i s s n 1 0 0 6 - - 9 0 7 0 2 0 1 0 0 2 0 0 5 收稿日期:2 0 1 0 0 1 一0 6 作者简介:郑玉群( 1 9 8 2
11、一) 。女,山东章丘人,在读硕士研究生。 万方数据 江苏预防医学2 0 1 0 年3 月第2 1 卷第2 期J i a n g s uJP r e yM e d ,M a r c h ,2 0 1 0 ,V o L2 1 ,N o 2 1 5 d u c e di m m u n o m a g n e t i eb e a d s T h ei m m u n o m a g n e t i cb e a d sw e r eU S e di nc a p t u r i n gm y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i sf r o ms
12、p u t u m M y c o h a c t e r i u mt u b e r c u l o s i sw a se l u t e df r o mi m m u n o m a g n e t i cb e a d sa n ds m e a r e da n t i a c i ds t a i n e da n dP C I LR e s u l t s :蹦S s m 韶t fs t a i n i n gm e t h o da n dI M S P c Ru s e di nt h ed e t e c t i o no fm y e o b a c t e r i
13、u mt u b e r c u l o s i si ns p u t u mh a dh i g h e rp o s i t i v er a t e s t h a nd i r e c t - - s m e a ra n dP C I LC o n c l u s i o n :I M S - - s m e a rs t a i n i n gm e t h o da n dI M S P C Rt e c h n i q u ea r ew o r t h yt Ob er e c o m m e n d e di ne l i n i c a lu s ed u et Oe
14、a s ya n dm o r es e n s i t i v e I K e yW o r a s li m m u n o m a g n e t i cb e a ds e p a r a t i o n ;s p u t u m t m y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s ;s m e a r ;P C R 结核病是严重威胁人类健康的慢性传染病。肺结 核是结核病的最常见类型,由于缺乏有效疫苗,加上结 核菌空气传播途径又难以切断,因而及早发现并治愈 病人是当前唯一可行的结核病控制策略。痰涂片抗酸 染色镜检是诊断结核病最常用的方法
15、,因其简单、快 速、准确性高,是美国C D C 和W H O 等组织推荐诊断 肺结核首选和必选的检测方法,但其敏感性低已是人 所共知。P C R 检测与传统的痰直接涂片和结核杆菌 分离培养相比较,具有敏感、快速等优点,特别适用于 生长缓慢的结核分枝杆菌的诊断,因此近年来已逐渐 应用于基层实验室,但假阴性与假阳性的存在仍限制 其临床应用。免疫磁珠分离技术( i m m u n o m a g n e t i e b e a ds e p a r a t i o n ,I M S ) 是近年快速发展的一种免疫学 检测和分离技术。本研究以I M S 技术为基础对现有 的涂片和P C R 检测痰中结核
16、分枝杆菌方法进行科学 的改进,现对其诊断价值作进一步研究。 1 材料与方法 1 1 对象与标本病例组1 3 0 份痰标本均来源于南 京市胸科医院的住院病人。其中男性9 5 例,女性 3 5 例,年龄1 6 一- - 8 5 岁,平均5 2 7 2 岁。所有病例均根 据临床症状、体征、细菌学、胸部影像学检查或抗结核 药物治疗而确诊,且接受抗结核药物治疗时间不超过 1 个月。对照组5 1 例,为南京市胸科医院住院的其他 肺部疾病患者,男性2 9 例,女性2 2 例,年龄2 7 9 1 岁。所有研究对象均于清晨漱口后留取晨痰标本。 1 2 磁珠及包被采用纯化抗体包被磁珠,其中表面 活化磁珠购买于上海
17、普飞生物技术有限公司,兔抗 H 3 7 R v 血清由国家C D C 传染病所提供。将磁珠彻底 混匀,取1m l 装入灭菌E P 管,磁铁收集后将液体弃 去。用lm l 包被缓冲液重悬磁珠,洗涤2 次。最后一 次移去液体后,加入1m l 包被缓冲液稀释的纯化抗 体室温下于垂直混匀仪上3 0r p m 孵育2 4h 。孵育后 磁铁收集磁珠,弃去液体,向管中加入1m 1 洗涤液 ( O 1 的l i S A 的P B S ) ,4 洗涤磁珠,5m i n 后弃液 体。重复洗涤2 次后加入1m l 洗涤液,4 保存备用。 1 3 检测操作 1 3 1 直接涂片法:涂片的制备及染色依据结核病 诊断细菌
18、学检验规程操作口 。 1 3 2 免疫磁珠技术分离涂片检测痰液中结核分枝 杆菌:标本处理,取痰标本2m l 左右加入1 1 5 倍 消化剂,涡旋震荡3 0s ,室温静置1 5m i n ,其间摇动数 次,使痰液完全液化无痰丝。如标本过于粘稠,可适当 延长液化时间,待标本完全液化;磁性分离,向液化 痰中加入0 1M 盐酸溶液混匀调节混合液p H 值至 7 - - 一8 ,加入包被好的磁珠5 0 肛l ,置垂直混匀仪上反应 2 0m i n ,收集磁珠;分离菌体的检测,将收集到的磁 珠加入5 0 p l 生理盐水悬浮,用吸管吸出加一滴蛋清涂 片,抗酸染色后镜检。 1 3 3 痰中T BD N A
19、的检测:模板制备,标本处理 方法同前,两只E P 管各取1m l 液化痰,50 0 0r p m 离 心1 0m i n ,生理盐水洗涤两次后,一只加入1 0 0g l 无 R N A 水煮沸1 0r a i n ,1 20 0 0r p r n 离心1 0m i n 后取上 清。另一只用1m l 生理盐水悬浮沉淀,磁性分离后收 集磁珠,洗涤缓冲液洗涤2 次,加入1 0 0 弘1 无R N A 水 煮沸1 0m i n ,取上清为模板;P C R 扩增及产物检测, 引物为结核分枝杆菌复合体重复序列I S 6 1 1 0 保守区 域,引物1 ( C G T G A ( X ;G C A T C
20、G A G G T G G C ) 、引物 2 ( ( 圯G T A G G C G T C ( X ;T G A C A A A ) 由上海生工生物 工程有限公司合成,扩增产物为2 4 5b p 。P C R 扩增采 用5 0 弘l 体系,体系包含1 0 P ( 、RB u f f e r 、d N T P 、M _ g C l 2 、 上下游引物、2 U T a q 酶、无R N a s e 去离子水和5 肛l 模板 D f 、A 。反应条件为9 4 预变性1 0m i n ,然后9 4 变性 1m i n ,6 2 复性1m i n ,7 2 延伸1 5m i n ,3 5 个循环,最
21、后7 2 延伸l O m i n 。取5 川P ( :R 产物经1 2 的含G o l d - v i e w 染料的琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察,于2 4 5b p 处出现扩增条带者为阳性。 1 4 数据处理检测数据应用S P S S1 3 0 统计软件 进行统计分析,采用配对四格表妒检验比较磁珠分离 前后涂片、P C R 法的灵敏度、特异度及检出率, P O 0 5 为差异有显著性。 2 结果 2 1 4 种方法的比较1 3 0 例确诊患者的痰标本中, 直接涂片染色镜检为阳性者2 6 例,灵敏度为2 0 o o , I M s 一涂片染色镜检阳性3 4 例,灵敏度为2 6 1 5 ,两 万
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