双类似物鼻黏膜耐受对实验性自身免疫性重症肌无力幼鼠作用机制的研究.pdf
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1、实验研究 双类似物鼻黏膜耐受对实验性自身免疫性 重症肌无力幼鼠作用机制的研究 刘仕林,黄志 ( 重庆医科大学附属儿童医院神经内科,重庆4 0 0 0 1 4 ) 【摘要目的对实验性自身免疫性重症肌无力( E A M G ) 幼鼠选择双类似物( L y s 2 6 2 一A l a 2 0 7 ) 通过不同时 问点进行鼻黏膜免疫耐受预防性给药后,观察其临床及免疫指标的变化,评价l 临床疗效及探讨鼻黏膜耐受对 E A M G 的预防作用机制。方法用乙酰胆碱受体单克隆抗体建立C 5 7 B L 6 小鼠E A M G 模型,并在致敏前1 0d ( A 组) 及致敏当日( B 组) 经鼻黏膜滴入L y
2、 s 2 6 2 一A l a 2 0 7 诱导黏膜耐受,检测给药后A ,B 组及相应对照组C A 组、c B 组 小鼠的临床症状及各项指标的改变情况。结果A ,B 两组临床症状明显轻于相应对照组,且A 组I 临床症状轻于 B 组。A ,B 组低频重复电刺激( R N S ) 出现衰减的阳性率低于各自对照组;A ,B 两组小鼠血清乙酰胆碱受体抗 体A c h R A b ( I g G ) 水平明显低于各自对照组,且A 组轻于B 组。调节性c D 4 + c D O T 细胞含量A 组( 4 5 1 6 4 - 0 5 9 8 ) 明显高于B 组( 3 6 7 1s 0 3 0 0 ) ,且A
3、 ,B 组明显高于各自对照组。结论L y s 2 6 2 A l a 2 0 7 鼻黏膜预防耐受可 有效地抑制重症肌无力的临床症状,为采用该途径治疗重症肌无力的可行性提供了理论依据。 中国当代儿科杂志。2 0 0 8 ,1 0 ( 2 ) :1 9 1 1 9 4 1 关键词 实验性自身免疫性重症肌无力;单克隆抗体;鼻黏膜耐受;双类似物;小鼠 中图分类号 R 一3 3 文献标识码】A【文章编号 1 0 0 8 8 8 3 0 ( 2 0 0 8 ) 0 2 0 1 9 1 0 4 T h em e c h a n i s mo fp r o p h y l a c t i ce f f e c
4、 t so fn a s a lt o l e r a n c ew i t had u a la n a l o g u eo ne x - p e r i m e n t a la u t o i m m u n em y a s t h e n i ag r a v i si ny o u n gm i c e L I US h i L i n ,H U A N GZ h i D e p a r t m e n to fN e u r o l o g y 。C h i l d r e n 5H o s p i t a lA f f i t i a t e dt O C h o n g q
5、 i n g4 0 0 0 1 4 ,C h i n a ( H u a n gZ ,E n t a i l :h u a n g z h i 3 5 0 0 y a h o o c o r n c r t ) A b s t r a c t :O b j e c t i v eT os t u d yt h ep r o p h y l a c t i ce f f e c t so fn a s a lt o l e r a n c ew i t had u a la n a l o g u e ,L y s 2 6 2 一A l a 2 0 7 ,o n 山em O l l s em o
6、 d e lo fe x p e r i m e n t a la u t o i m m u n em y a s t h e n i ag r a v i s ( E A M G ) a n dt h eu n d e r l y i n gm e c h a n i s m M e t h o d sM o u s e m o d e lo fE A M Gw a gi n d u c e db yi n t r a p e r i t o n e a li n j e c f i o no fm A b 3 5 L y s 2 6 2 A 1 a 2 0 7o rP B Sw a sg
7、 i v e nn a s a l l yb e f o r e1 0 d a y s ( s t u d yg r o u pAa n dc o n t r o lg r o u pA ) o ro nt h ed a y ( s t u d yg r o u pBa n dc o n t r o lg r o u pB ) o fi m m u n i z a t i o nf o r1 0d a y s C l i n i c a ls y n d r o m e sw e r ee v a l u a t e da f t e ri m m u n i z a t i o n S e
8、r u ml e v e lo fa c e t y l c h o l i n er e c e p t o ra n t i b o d y ( A C h R A b ) I g Gw a s d e t e c t e du s i n gE L I S A T 1 1 en u m b e ro fm o n o u c l e a rc e i l se x p r e s s i n gC I M + a n dC 1 ) 4 + C D 2 5 + Tf r o ms p l e e nw a sm e a s u r o d u s i n gf l o we y t o m
9、 e t r y R e s u l t s C o m p a r e dw i t ht h ec o r r e s p o n d i n gc o n t r o lg r o u p s ,t h ec l i n i c a ls y n d r o m e sw e r ei m p r o v e d ( P 1 0 者为阳性。 1 3 3 血清抗A C h R A b ( I g G ) 水平的检测由 小鼠股动脉取血并分离血清,用E L I S A 法测定小鼠 血清A C h R A b 滴度( 包被好的n A C h R 酶标板由上 海华山医院神经免疫生化室提供) 。 1
10、 3 4C D 4 + C D 2 5 + 调节性T 细胞测定 小鼠处 死后,无菌条件下去脾脏F i l l c o U 法分离,制成 2 1 07 m 蝉个核细胞( M N C ) 悬液,设复孔,分别加 1 9 2 万方数据 第1 0 卷第2 期 2 0 0 8 年4 月 中国当代儿科杂志 C h i nJC o n t e m pP e d i a t r V o I 1 0N o 2 A p r 2 0 0 8 人2 0 L 荧光标记的抗小鼠单抗( F I T C - 抗C D 4 、P E 一 抗C D 2 5 ) ,并作阴性对照。2 4h 内用流式细胞仪检 测,测定1 00 0 0
11、个细胞,结果以C I M + C D 2 5 + T r 细 胞占C D 4 + 细胞的百分比表示。 1 4 统计学处理 所有原始数据建立数据库,以均数标准差 ( 孑s ) 表示,应用S P S S l l 5 统计软件进行分析。配 对样本比较采用t 检验。 2结果 2 1 症状观察临床评分 实验小鼠致敏后均出现不同程度的肌无力症 状,其中实验滴鼻( 麻醉) 过程中A 组小鼠有1 只死 亡,B 组有3 只死亡;由于肌无力症状加重导致C A 组4 只小鼠死亡,C B 组5 只死亡,临床评分为3 分。 其中A 组与C A 组,B 组与C B 组在致敏后6 8h 时部分出现临床症状,表现为摄食、运动
12、减少,毛皱、 易脱落失去光泽;2 4h 均表现轻重不等的E A M G 症 状,临床评分差异均有显著性意义( P 1 0 ) ,C A 组与C B 组 小鼠R N S 平均衰减率均 1 0 ,为阳性。A 组与B 组小鼠R N S 平均衰减率 1 0 ,均为阴性,但二者 比较差异有显著性( 尸 0 0 5 ) 。见表1 。出现R N S 衰减的小鼠经腹腔注射新斯的明,1 0 1 5m i n 后再 行R N S 检查,均不出现波幅的衰减,提示新斯的明 试验阳性。 2 3 血清抗A C h R - A b ( I g G ) 水平的检测 对小鼠血清中的A C h R A b 水平通过E L I S
13、 A 法 进行定量检测,结果见表2 。从表中可以看出致敏 后,A 组、B 组大鼠血清抗A C h R A b ( I g G ) 含量明显 目前,国内外对M G 的免疫治疗主要采用皮质 类固醇及免疫抑制剂,但这种非特异性治疗通常不 能完全控制免疫反应,且停药后易复发。预防M G 发病的主要目的是下调A C h R 特异性免疫反应,防 止异常免疫反应。最初用完整的电鳗A C h R 口服耐 受虽然取得了一定的疗效,但追踪观察发现可使部 分大鼠病情加重“ J ,推测与A C h R 本身分子量极大 和具有高度致病性有关,且所需耐受量大,作用微 弱,维持有效耐受时间短暂。双类似物L y s 2 6
14、2 一 A l a 2 0 7 是经过改良使免疫原性减弱后的肽段,除具 有很好的安全性外,还具有下调人类针对A C h R 自 身免疫反应的作用。鼻黏膜免疫耐受不需要确定作 用部位,并有特异性免疫抑制的优点,优势是抗原剂 1 9 3 3 5 2 5 1 5 O 2 1 O 求牲长磐 万方数据 第1 0 卷第2 期 2 0 0 8 年4 月 中国当代儿科杂志 C h i nJC o n t e m pP e d i a t r V 0 1 1 0N o2 A p r 2 0 0 8 量用微克计,约为口服耐受剂量的1 1 0 0 1 10 0 0 , 所以采用鼻黏膜耐受。 本研究应用L y s 2
15、 6 2 - A l a 2 0 7 预防性免疫耐受A , B 组后,实验小鼠的病情明显轻于相应对照组,且A 组耐受效果优于B 组。在对实验小鼠做重复神经 电刺激,通过检测肌电图衰减率的结果也证实了这 一结果。M G 患者血清中的A C h R 特异性I g G 抗体 是M G 最主要的致病因子,小鼠致敏后测定血清的 A C h R 抗体I g G 含量,A ,B 组均低于各自对照组,且 A 组低于B 组。本实验结果表明,L y s 2 6 2 - A l a 2 0 7 经 鼻黏膜耐受不仅可以有效的抑制临床症状,而且伴 有A C h R 特异性I g G 致病性抗体含量减少,说明 L y s
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