吡格列酮对高糖高胰岛素诱导的心肌细胞肥大的影响.pdf
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1、8 1 8 中国药理学通报C h i n e s e P h a r m a c o l o g i c a l B u l l e t i n 2 0 0 4 J u l ; 2 0 ( 7 ) ; 8 1 8 - 2 1 毗格列酮对高糖高胰岛素诱导的心肌细胞肥大的影响 周庆峰, 王洪新, 王怡薇, 单丹, 符丽娟 ( 锦州医学院药理学 教研室, 辽宁饰州 1 2 1 0 0 1 ) 中图书分类号:R - 3 3 2 ; R 3 2 2 . 1 1 ; R 3 2 9 . 2 4 ; R 3 2 9 . 2 5 ; R 5 4 2 . 2 0 5 . 3 ; R 5 8 7 . 1 0 5
2、. 3 ; R 9 7 7 . 1 5 文献标识码: A 文章编号: 1 0 0 1 一 1 9 7 8 ( 2 0 0 4 ) 0 7 一 0 8 1 8 一 0 4 摘要: 目的利用体外培养的乳鼠心肌细胞, 观察毗格列酮 对高浓度葡萄糖与高浓度胰岛素共同诱导的肥大心肌细胞 的影响, 进一步推测毗格列酮对糖尿病并发心肌肥大的可能 作用及作用机制。方法以培养的乳鼠心肌细胞为模型分 组给药后, 用 L o w ry s 法测心肌细胞的蛋白质含量; 用 3 H I l e u c i n e 标记法测定心肌细胞蛋白的合成; 利用计算机图像分 析系统测心肌细胞的体积; 用显微镜目 镜计数心肌细胞搏动
3、 的 频率。 结果 1 0 N .m o l L - 浓度的毗格列酮在对高糖高 胰岛素诱导的肥大心肌细胞的蛋白含量、 蛋白合成及体积均 有显著的抑制作用。其抑制肥大的效果比维拉帕米更为明 显; 同时观察到毗格列酮同维拉帕米一样有抑制心肌细胞搏 动的作用。结论毗格列酮能有效抑制高糖高胰岛素诱导 的心肌细胞肥大。 这种作用可能是通过作用于P P A R , 来实 现的。 关键词: 毗格列酮; 高糖; 高胰岛素; 心肌细胞肥大 高糖高胰岛素血症在2 型糖尿病并发心肌肥大 的过程中起着关键的作用。我们已发现高血糖直接 参与了 糖尿病并发心肌肥大过程川, 国内洪华山 等 也证明, 高浓度胰岛素可促使培养
4、的心肌细胞 肥大。毗格列酮是唾哇烷二酮类衍生物, 为一种新 型有效的抗糖尿病药物, 已知其通过激活过氧化物 酶 体增 生物激活受 体P P A R y ( p e r o x i s o m e p r o l if e r a t o r a c t i v a t e d r e c e p t o r -y ) 而起胰岛素增敏作用。最新研 究证明, 毗格列酮能通过P P A R , 抑制内皮素一 1 诱导 的 心肌细胞肥大 。 A s a k a w a 等通过体内 体外实验 证明毗格列酮通过P P A R , 也可抑制压力负荷所致 的 心肌 肥大4 l 。 但是毗格列酮是否能抑制高糖高
5、 胰岛素所诱导的心肌细胞肥大, 仍未见明确报道。 本实验利用培养的心肌细胞, 在高糖高胰岛素诱导 心肌细胞肥大的基础上观察毗格列酮对肥大心肌细 收稿日 期: 2 0 0 3 一 1 1 一 1 7 , 修回日 期: 2 0 0 3 - 1 2 - 0 2 作者简介: 周庆峰( 1 9 7 7 一 ) , 男, 硕士, 研究方向: 心血管药理学, T e l ; 0 4 1 6 -4 5 8 0 0 5 0 , E - m a i l : z h o u g i n g f e n g 7 1 5 y a h o o . c o m . c n ; 王洪新 ( 1 9 6 4一) , 男, 博士
6、后, 教授, 硕士生导师, T e l ; 0 4 1 6 - 4 5 8 0 2 0 9 , E - m a il ; j y h x w a n g h o t m a i l . c o m 胞的影响, 同时用钙离子拮抗剂维拉帕米进行对比 分析, 进而推测毗格列酮的作用机制。 1 材料与方法 1 . 1 实验动物出生2d的S D大鼠乳鼠, Ya不 拘, 由锦州医学院实验动物中心提供。 1 . 2 药品与试剂 T ry p s i n , S D S , D M E M培养基, 葡 萄糖, 胰岛素, 维拉帕米均为S i g m a 公司产品; 毗格 列酮为天津正元精细化工有限公司产品; 牛
7、血清白 蛋白为北京化学试剂公司产品; 小牛血清为杭州四 季青生物材料研究所产品; 3 H l e u c i n e 为上海原子 核研究所产品; 其它试剂均为分析纯。 1 . 3 体外乳鼠心肌细胞原代培养取出生2d的 S D大鼠乳鼠, 在无菌的条件下, 开胸取出心脏, 用 D - H a n k s 液冲洗3 次后剪成约1 m m 3 大小的碎块, 加人0 . 6 g “ L - 胰蛋白 酶消化细胞, 取消化完毕后 的细胞, 加人体积分数为0 . 1 5的小牛血清, 0 . 8 4的 D M E M培养基, 及0 . 0 1 的双抗液( 含1 x 1 0 5 u L 一 青霉素, 1 0 0
8、m g L 一 链霉素) 的培养基, 吹打均匀 后以1 x 1 0 8 L - 的密度接种于2 4 孔培养板, 送人 通以体积分数为0 . 0 5 C O : 及0 . 9 5 空气的二氧化碳 孵箱中培养。 1 . 4 实验分组及给药方法常规培养心肌细胞4 8 h 后, 换液为无血清的D M E M培养基。将2 4 孔培养 板上的细胞每6 孔分为一组, 共分4 组, 换培养基 的同时给药, 每组给药如下: 第1 组为正常对照组; 第2 组为给予2 5 . 5 m m o l L 一 葡萄糖和1 0 - m o l L 一 胰岛素的高 糖高胰岛素 组; 第3 组为在第2 组基 础 上 加人1 0
9、 L m o l L 一 的 毗 格列酮组 ; 第4 组为 在第2 组基础上 加人浓度为1 FL m o l L 一 的维拉帕 米组 ; 给药4 8 h 后进行各项指标的 测定。 1 . 5 培养心肌细胞蛋白质含f的测定吸去培养 板各孔中的培养液, 用D - H a n k s 液快速冲洗3 次后, 加人1 0 g L 一 S D S ( 十 二烷基硫酸钠) 0 . 5 m l 溶解 细胞, 根据计数, 每孔细胞数约为1 x 1 0 , 个, L o w ry s 法测每孔细胞蛋白质含量。 1 . 6 培养心肌细胞体积测f通过测量细胞直径 获得。用D - H a n k s 液快速冲洗长满细胞
10、的培养孔3 次, 每 孔加0 . 3 m l l g “ L - 胰蛋白酶, 放人3 7 恒 温箱中1 0 m i n 后, 再加人0 . 2 m l 含有体积分数为 万方数据 中国药理学通报C h i n e s e P h a r m a c o l o g i c a l B u l l e t i n 2 0 0 4 J u t ; 2 0 ( 7 ) 8 1 9 0 . 1 血清的培养基终止消化, 收集细胞注人一细胞 室内, 用计算机 C I A S大恒细胞图像分析系统测量 单个细胞的直径, 进而计算出细胞的体积。每孔随 机选择4个视野, 每个视野测2 0 个细胞。 1 . 7 培养
11、心肌细胞蛋白质合成的测定将生长在 2 4 孔培养板上无血清静止培养了4 8 h的细胞培养 液 倒掉, 代之以 含有3 7 T B q L 一 H l e u c i n e 及各 种 浓度的 试剂。 倒掉培 养 液, 每 孔 加1 m 1 l o g L 一 的S D S 溶解细胞, 用1 m l 0 . 2 k g L - 的三氯醋酸 ( T C A ) 沉淀蛋白, 应用4 9型玻璃纤维滤膜( G F / C ) 过滤, 烘干滤膜, 用液闪仪测量 1 1 l e u c i n e 的结合, 进行蛋白合成的分析。根据计数, 每孔的细胞数大 致为1 x 1 0 3 个, 实验结果以 每孔的c
12、p m值计算。 1 . 8 培养心肌细胞搏动次数的测定将倒置显微 镜置于有机玻璃保温箱内。箱内采用恒温气体对流 装置, 使观测中的培养板始终为3 7 恒温气流所覆 盖。用放大倍数为4 0 0 倍的目 镜镜下观察并计数心 肌细胞的搏动频率。每孔随机选择4个视野, 每个 视野计2 0 个细胞。 1 . 9 统计学处理所有数据均以x 土 表示, 统计 学处理采用t 检验。 2 结果 2 . 1 毗格列酮对高糖高胰岛素诱导的肥大心肌细 胞蛋白含t的影响各组间分别加入不同处理因素 4 8 h 后, 用L o w ry s 法测定每孔细胞的O D值。与正 常对照组相比, 高糖高胰岛素组心肌细胞蛋白含量 增
13、加了2 8 . 3 %, P 0 . 0 1 , 与高糖高胰岛素组相比, 毗格列酮组的心肌细胞蛋白含量减少了1 7 . 1 % , P 0 . 0 1 , 差 异有显著性, 表明1 0 t m o l “ L 浓度的 毗格列酮能有效减少肥大心肌细胞的蛋白含量。维 拉帕米组与高糖高胰岛素组相比, 心肌细胞蛋白含 量减少了6 . 6 %, P 0 . 0 5 , 差异亦有显著性。与维 拉帕米组相比, 毗格列酮组的蛋白含量减少, P 0 . 0 1 。见 T a b 1 。 2 . 2 毗格列酮对高糖高胰岛素诱导的肥大心肌细 胞体积的影响同上加人不同处理因素4 8 h 后, 测 各孔细胞体积。与正常
14、对照组相比, 高糖高胰岛素 组的体积增加了3 0 . 4 %, P 0 . 0 1 , 与高糖高胰岛素 组相 比, 毗格列酮组 的心肌细胞体积减少 了 1 1 . 4 %, P 0 . 0 1 , 维拉帕米组与高糖加N E 组相比, 心肌细胞体积减少了8 . 9 %, P 0 . 0 1 , 差异有显著 性。毗格列酮组与维拉帕米组相对比, 体积减少量 更为明显( P 0 . 0 5 ) 。见T a b 2 0 2 . 3 毗格列酮对高糖高胰岛素诱导的肥大心肌细 胞蛋白合成的影响 将 s H l e u c i n e 与心肌细胞共 T a b 1 E f f e c t s o f p i o
15、 g l i t a z o n e o n t h e c e l l u l a r p rot e i n c o n t e n t o f h y p e r t rop h i c h e a rt c e ll s o f n e o n a t a l r a t s i n d u c e d w it h h i g h g l u c o s e a n d h i g h i n s u l i n ( x t s , n 二 6 ) G ro u p c e l l u l a r p ro t e i n c o n t e n t C o n t rol H i
16、g h g l u c o s e + h i g h i n s u l in H i g h g l u c o s e + h i g h in s u l i n + p i o g l i t a z o n e H i g h g l u c o s e + h i g h i n s u l i n + v e r a p a m i l 2 0 . 0 9 12 . 7 4 2 5 . 7 8士3 . 6 1 . 申 2 1 . 3 7士 2 . 6 4 “ “ 0 0 2 4 . 0 7士 2 . 9 2 “ * P 0 . 0 1 v s c o n t r o l ; “
17、 P 0 . 0 5 , # # P 0 . 0 1 v s h i g h g l u c o s e + h i g h i n s u l i n ; 尸 0 . 0 1 “h i g h g l u c o s e + h i g h i n s u l i n + v e r a p a m il T a b 2 E f f e c t s o f p i o g l i t a z o n e o n c e l l u l a r v o l u m e o f h y p e r t rop h i c h e a rt c e l l s o f n e o n a t a
18、l r a t s i n d u c e d w i 比 h i g h g l u c o s e a n d h i g h i n s u l i n ( x 士 s , n = 8 0 ) Ce l l u l a r v o l u me G r o u p C o n t rol H i g h g l u c o s e + h i g h i n s u l i n H ig h g l u c o s e + h i g h i n s u l i n + p i o g l i t a z o n e H i g h g l u c o s e + h i g h i n
19、 s u l i n + v e r a p a m i l / u m 3 s i n e l e c e l l 一 I 1 6 2 6 . 5 8 13 8 2. 8 4 2 1 2 1 . 0 6 15 4 6 . 3 2. * 1 8 7 9 . 2 6:09 6 . 5 1 材 1 9 3 2 . 2 8 1 4 7 3 . 8 3 “ * 巾 P 0 . 0 1 v s c o n t r o l ; * * P 0 . 0 1 v s h ig h g l u c o s e + h ig h i n s u l i n ; P 0 . 0 5 v s h i g h g l
20、u c o s e + h i g h i n s u l i n + v e r a p a m i l 同 培养4 8 h 后, 用液闪仪测量各孔细胞与 3 H l e u - c i n e 的结合, 进行蛋白合成的分析。与正常培养的 对照组相比, 高糖高胰岛素组的蛋白合成增加了 4 1 . 4 %, P 0 . 0 1 , 毗 格列酮组的 心肌细胞蛋白 含量 减少了2 2 . 7 %, P 0 . 0 1 , 差异有显著性, 维拉帕米 组与高糖高胰岛素组相比, 心肌细胞蛋白合成减少 了1 7 . 2 % , P 0 . 0 1 , 差异有统计学意义。 与维拉帕 米组相对比, 毗格列酮组
21、蛋白合成减少( P 0 . 0 1 ) “ 见 T a b 3 。 T a b 3 E f f e c t s o f p i o g l i t a z o n e o n c e l l u l a r p rot e i n s y n t h e s i s o f h y p e r t rop h i c h e a r t c e l l s o f n e o n a t a l r a t s i n d u c e d w i t h址 曲 g l u c o s e a n d h i g h i n s u l i n ( x 士 : , n = 8 0 ) G ro
22、u p C e l l u l a r p ro t e i n s y n t h e s i s C o n t rol H i g h g l u c o s e + h i g h i n s u l i n H i g h g l u c o s e + h i g h i n s u l i n + p io g l i t a z o n e H i g h g l u c o s e + h i g h i n s u l i n + v e r a p a m i l 1 0 0 3 . 5 4 11 0 7 . 1 9 1 4 1 9 . 0 1 13 9 6 . 7 5.
23、 , 1 0 9 6 . 8 9 1 5 0 1 . 2 4 “ “ 0 0 1 1 7 4 . 9 4士 4 3 2 . 0 3 “ “ 二P 0 . 0 1 。c o n t ro l ; “ P 0 . 0 1 v s h i g h g l u c o s e + h i g h i n s u l i n ; 0 0 P 0 . 0 1 v s h i g h g l u c o s e + h i g h i n s u l i n + v e r a p a m i l 2 . 4 毗格列酮对高糖和高胰岛素诱导的肥大心肌 细胞搏动频率的影响各组间分别加人不同处理因 素4 8 h
24、后, 计数心肌细胞搏动频率。与正常对照组 相比, 高糖高胰岛素组心肌细胞搏动频率增加了 9 . 1 %, P 0 . 0 5 , 与高糖高胰岛素组相比, 毗格列酮 万方数据 8 2 0 中国药理学通报C h i n e s e P h a r m a c o l o g i c a l B u l l e t i n 2 0 0 4 J u 1 ; 2 0 ( 7 ) 组的心肌细胞搏动频率减少了1 3 . 5 %, P 0 . 0 1 , 差 异具有显著性。维拉帕米组与高糖高胰岛素组相 比, 心肌细胞搏动频率减少了1 1 . 2 %, P 0 . 0 1 , 差 异有显著性。 见T a b 4
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