呼吸机所致肺损伤肿瘤坏死因子α的表达及核因子κB活性的实验研究.pdf
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1、专题报道 呼吸机所致肺损伤肿瘤坏死因子 - 的表达及 核因子 - k B活性的实验研究 张隽王辰*庞宝森秦志强牛淑洁马力毛燕玲 (首都医科大学附属北京朝阳医院, 北京呼吸疾病研究所) 【摘要】 目的研究呼吸机所致肺损伤 (V I L I) 时肿瘤坏死因子- (T N F - ) 的表达及核因子- k B(N F - k B) D N A结合活性的变化, 探 讨V I L I炎症反应的分子生物学机制。方法应用大潮气量 (V T) 机械通气建立兔V I L I模型。4 0只雄性新西兰兔随机分为对 照组、 常规V T组、 损伤1h组、 2h组及4h组。用酶联免疫吸附法 (E L I S A) 检测肺
2、组织匀浆T N F - 含量, 反转录多聚酶链反应 (R T - P C R) 检测m R N A表达。凝胶电泳迁移率分析法 (E M S A) 测定N F - k B的活性。同时检测动脉血氧分压 (P a O 2) 和肺湿质量 干质量比值 (WD) 及肺组织病理学检查。结果 1)损伤4h组P a O2较常规V T组显著降低 (P 0 . 0 5) , 损伤4h组WD较对 照组和常规V T组显著升高 (P均 0 . 0 1) 。2)损伤2h组和损伤4h组肺组织匀浆中T N F - 含量均显著高于对照组和常规V T 组 (P均 0 . 0 1) 。各损伤组T N F - m R N A含量均显著
3、高于对照组和常规V T组 (P均 0 . 0 1) , 损伤4h组高于损伤1h组 (P 0 . 0 1) 和损伤2h组 (P 0 . 0 5) 。3)各损伤组N F - k B的D N A结合活性均显著高于对照组和常规V T组 (P均0 . 0 1) ,2h活性 达峰值, 4h仍维持在高水平。结论T N F - 升高参与了V I L I的炎症反应过程, 其升高可能与其m R N A表达增高有关。N F - k B 的D N A结合活性增高可能参与了V I L I时T N F - 的基因转录过程。 【关键词】 呼吸机所致肺损伤;核因子- k B;肿瘤坏死因子- 【中图分类号】R5 6 3 . 9
4、 T u L o rN e c r o s i sF a c t o r - E x p r e s s i o na n dN u c l e a rF a c t o r -k a p p aB A c t i v a t i o n i nV e n t i l a t o r - I n d u c e dL u n g I n j u r y i nR a b b i t s Z h a n g J u n,W a n gC h e n *, P a n gB a o s e n,Q i nZ h i q i a n g,N i uS h u j i e,M aL i,M a oY
5、a n l i n g (B e i j i n gC h a o y a n gH o s p i t a l,B e i j i n g I n s t i t u t e o fR e s p i r a t o r yM e d i c i n e,C a p i t a lU n i v e r s i t y o fM e d i c a l S c i e n c e s) 【A B S T R A C T】O b j e c t i v e T h e e x p r e s s i o no f t u m o rn e c r o s i s f a c t o r - (
6、T N F - )a n dt h ea c t i v a t i o no fn u c l e a r f a c t o r -k a p p aB(N F - k B) w e r e e x a m i n e d i no r d e r t o i n v e s t i g a t e t h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo f v e n t i l a t o r - i n d u c e d l u n g i n j u r y (V I L I).M e t h o d s T h eV I L Im o d e l w
7、a s e s t a b l i s h e db ym e c h a n i c a l v e n t i l a t i o nw i t h aV To f 4 0m Lk g . F o r t yh e a l t h ym a l eN e wZ e a l a n d r a b b i t sw e r e r a n d o m l yd i v i d e d i n t o c o n t r o l g r o u p,c o n v e n t i o n a lv e n t i l a t i o ng r o u pa n dV I L Ig r o u
8、p .T h ec o n c e n t r a t i o n so fT N F - i nl u n gh o m o g e n a t ew e r em e a s u r e db y e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y (E L I S A). T h eT N F - m R N Aw a sm e a s u r e db ys e m i - q u a n t i t a t i v e t r a n s c r i p t i o n - p o l y m e r a s e
9、c h a i n r e a c t i o n(R T - P C R). T h eD N A - b i n d i n ga c t i v i t yo fN F - k Bw a sd e t e c t e db ye l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f ta s s a y(E M S A). T h ep a r t i a l a r t e r i a l b l o o dp r e s s u r e o f o x y g e n(P a O2) ,w e t l u n gw e i g h t t
10、 od r y l u n gw e i g h t r a t i o(WD)a n dh i s t o l o g i c a l c h a n g e s o f l u n g t i s s u ew e r e a l s o i n v e s t i g a t e d . R e s u l t s 1)A f t e r 4ho f i n j u r i o u s v e n t i l a t i o n,P a O2w a s s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d c o m p a r e dw i t hc o n
11、v e n t i o n a l v e n t i l a t i o n g r o u p (P0 . 0 5). I nc o n t r a s t,t h eWDw a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dc o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p(P0 . 0 1)a n dc o n v e n t i o n a l v e n t i l a t i o n g r o u p (P 0 . 0 1). 2)T h e c o n c e n t r a t i o n s o
12、 f T N F - p r o t e i n s i n l u n g h o m o g e n a t e sw e r e s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d b y t h e i n j u r i o u s v e n t i l a t i o n f o r 2ho r 4h,c o m p a r e t o c o n t r o l g r o u p a n d c o n v e n t i o n a l v e n t i l a t i o ng r o u p(a l lP 0 . 0 1). T h
13、 eT N F - m R N Al e v e l s i na l l i n j u r i o u s v e n t i l a t i o ng r o u p sw e r e s i g n i f i c a n t l yh i g h e r t h a nc o n t r o l g r o u p (a l lP 0 . 0 1)a n dc o n v e n t i o n a l v e n t i l a t i o ng r o u p(P0 . 0 1). T h eT N F - m R N Al e v e l s i n d u c e db y
14、i n j u r i o u s v e n t i l a t i o n f o r 4hw e r e s i g n i f i c a n t l yh i g h e r t h a n t h a t i n d u c e db y i n j u r i o u s v e n t i l a t i o n f o r 1h(P 0 . 0 1)a n d2h(P 0 . 0 5). 3)T h eD N A - b i n d i n g a c t i v i t y o f o x y m a t r i n ew a s s i g n i f i c a n t
15、 l y i n c r e a s e d i n a l l i n j u r i o u s v e n t i l a t i o n g r o u p s c o m p a r e dw i t h t h a t o f c o n t r o l a n d c o n v e n t i o n a l v e n t i l a t i o ng r o u p (P0 . 0 1). T h eD N A - b i n d i n ga c t i v i t yo fN F - k Br e a c h e dt o m a x i m a l l e v e l
16、 a t 2h a n d r e m a i n e du n t i l 4h . C o n c l u s i o nT h em R N Aa n dp r o t e i n l e v e l o fT N F - a n dD N Ab i n d i n g a c t i v i t y o fN F - k Bw e r eu p - r e g u l a t e db yV I L I . I n c r e a s e dN F - k Ba c t i v i t y i n t h e l u n gm a yb e i n v o l v e d i n t
17、h e t r a n s c r i p t i o n a l u p - r e g u l a t i o no fT N F - . 基金项目:首都医学发展基金 (Z D1 9 9 9 0 1) 资助项目 *通讯作者 (C o r r e s p o n d i n ga u t h o r) 2 0 0 6年2月 第2 7卷第1期 首 都 医 科 大 学 学 报 J o u r n a l o fC a p i t a lU n i v e r s i t yo fM e d i c a l S c i e n c e s F e b . 2 0 0 6 V o l . 2 7 N
18、 o . 1 【K e yw o r d s】v e n t i l a t o r - i n d u c e d l u n g i n j u r y;n u c l e a r f a c t o r - k a p p aB;t u m o r n e c r o s i s f a c t o r - 呼吸机所致肺损伤 (v e n t i l a t o r - i n d u c e dl u n gi n - j u r y,V I L I) 为机械通气的严重合并症之一。近年的研 究表明, 炎症反应在V I L I的发生和发展过程中具有 重要作用, 但V I L I时肺脏产生
19、和释放大量炎症介质 的确切机制目前尚不十分明确。离体实验表明, 核因子- k B(N F - k B) 参与了V I L I炎症反应的信号转导 过程, 但是对在体情况下其是否亦具有此类作用目前 尚不清楚。 本研究应用大潮气量 (V T) 机械通气建立兔 V I L I模型, 探讨V I L I时T N F - m R N A的改变以及 N F - k BD N A结合活性的变化, 旨在进一步阐明V I L I 时炎症反应的分子生物学机制。 1 材料和方法 1 . 1 材料 T N F - E L I S A试剂盒由北京诺诗生物技术公司 提供。P C R引物由中国科学院微生物研究所合成。 引物序
20、列如下: T N F - f o r w a r dp r i m e r:5- G G CT A C G A AT C AG A CC T CA G - 3 ;r e v e r s ep r i m e r:5- G C T C C AC A TT G CA G AG A AG A - 3 。G A P D Hf o r w a r d p r i m e r:5- G A CA G GC A GC C GC T TC T - 3 ; r e v e r s e p r i m e r:5- C C AG T GA G TT T CC C GT T CA G - 3 。 N F - k B
21、寡核苷酸探针购自美国P r m e g a公司, 序列如 下: 5- A G TT G AG G GG A CT T TC C CA G GC - 3 ; 3- T C A A C T C C C C T G A A A G G G T C C G- 5 。 - 3 2P - A T P购自北京亚辉生物工程公司。 1 . 2 动物和分组 4 0只健康雄性新西兰兔 (由北京大学医学部实验 动物中心提供) , 体质量2 . 4 2 . 7k g, 随机分为5组。 对照组: 不行机械通气, 呼吸室内空气, 观察时间为 4h。常规通气组: 机械通气条件为V T1 0m L k g , 呼 吸频率 (R
22、 R) 4 0次 m i n, 氧体积分数 (F i O2)4 0 %, 机械 通气4h。损伤1h组、 2h组及4h组: 机械通气条件 为V T4 0m L k g , R R1 0次 m i n,F i O24 0 %, 机械通气 时间分别为1h、 2h和4h。 兔称质量后用2 0 %乌拉坦 (2m g k g ) 静脉注射 麻醉, 仰卧位固定于兔台, 行气管切开术及颈总动脉 插管术。术毕除对照组不进行机械通气外, 其余各组 均连接呼吸机。 通气方式为容积控制通气 (C MV) 。呼吸机参数 设置如下: V T1 0m L k g ,R R4 0m i n, F i O24 0 %, 吸 气
23、时间 (T i) 2 5 %, 吸气末暂停时间 ( T p ) 1 0 %。实验过 程中间断给予哌库溴胺0 . 3m g k g 以阻断自主呼吸。 机械通气后稳定3 0m i n(对照组手术完毕后稳定3 0 m i n) , 右颈总动脉取血, 作为血氧分压 (P a O2) 基础测 定值 (实验前) , 然后进入各实验分组。实验结束时, 右颈总动脉放血处死动物。迅速开胸取出完整肺组 织。取右下叶同一部位的肺组织 (约2 0 0m g) 迅速置 于液氮中保存, 用于提取R N A, 其余部位的肺组织置 于-8 0冰箱冻存, 用于提取核蛋白。取右中叶肺 组织, 置于4 %多聚甲醛中固定, 用于病理
24、检查。取右 上叶肺组织, 称肺湿质量, 然后置于干燥箱中8 0烤 至恒质量, 即肺干质量, 以湿质量 干质量比值 (WD) 表示肺组织含水量。 1 . 3 主要检测指标和方法 肺组织匀浆T N F - 含量用酶联免疫吸附法 (E L I S A) 检测, T N F - m R N A含量的检测应用半定量 反转录多聚酶链反应 (R T - P C R) , 以G A P D H作为标 准内对照。N F - k B的D N A结合活性测定应用凝胶电 泳迁移率分析法 (E M S A) , 将放射自显影图片进行计 算机扫描, 以积分灰度值表示其活性。 1 . 4 统计学分析 采用S P S S1
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- 关 键 词:
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