含绿色荧光蛋白及TRP3IAR基因的草菇表达载体的构建.pdf
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1、第 15 卷第 1 期上 海 水 产 大 学 学 报Vol.15,No.1 2006 年 1 月 JOURNAL OF SHANGHAI FISHERIES UNIVERSITYJan., 2006 文章编号:1004 - 7271 (2006) 01 - 0012 - 05 含绿色荧光蛋白及 trp3iar基因的 草菇表达载体的构建 收稿日期: 2005-07-08 基金项目: 上海市科学技术发展基金资助 (003912076) 作者简介: 孙晓红 (1978 - ) , 女, 江苏射阳人, 在读博士, 专业方向为真菌遗传育种。E-mail: 通讯作者: 陈明杰 (1965 - ) , 男
2、, 研究员。Tel: 021 - 52630034, E-mail: mjchen 孙晓红 1, 2,姚泉洪3,陈明杰2,潘迎捷4 (1.南京农业大学生命科学学院, 南京210095;2.上海市农业科学院食用菌研究所, 上海201106; 3.上海市农业科学院生物中心, 上海201106;4.上海水产大学, 上海 200090) 摘要: 分别用限制性内切酶 EcoR I 和 Hind III 酶切质粒 pBGgHg, 将切下的含双孢蘑菇 gpd 启动子、 EGFP 基 因和 35S 终止子的碱基序列连接到含 Ap 抗性的 pBSK II 上, 再 将 这 一 段 序 列 切 下 连 接 到
3、含 kan 抗 性 的 pCAMBIA1300 载体上, 形成中间质粒载体 YH2873。用限制性内切酶 Hind III 分别酶切质粒 YH2873 和质粒 pDB06, 将从 pDB06 切下的 trp3iar基因连接到中间质粒载 体 YH2873 上, 得 到 表 达 载 体 pSAGF。中 间 载 体 pYH2873 经限制性内切酶 EcoR I 和 Hind III 酶切, 电泳后显示 1.3 kb 的目的片断和 9 kb 的载体片断, 表达载 体 pSAGF 经限制性内切酶 Hind III 酶切, 电泳后显示 4 kb 的 trp3iar基因的目的片断和 10 kb 的载体片断,
4、 进一 步测序证明重组质粒连接正确, 成功构建了草菇的表达载体 pSAGF。 关键词: 草菇; EGFP 基因; trp3iar基因; 表达载体 中图分类号: S 188文献标识码:A Construction of expression vector of Volvariella volvacea with EGFP and trp3iargenes SUN Xiao-hong1, 2,YAO Quan-hong3,CHEN Ming-jie2,PAN Ying-jie4 (1. College of Life Sciences,Nanjing Agricultural University
5、,Nanjing210095, China; 2. Institute of Edible Fungi,Shanghai Academy of Agricultural Sciences,Shanghai201106,China; 3. Agro-Biotech Research Center,Shanghai Academy of Agricultural Sciences,Shanghai201106,China; 4. Shanghai Fisheries University,Shanghai200090,China) Abstract: Plasmid pYH2555 was gen
6、erated by exciting pBSK II with EcoR I and Hind III and inserting the promoter of gpd,EGFP gene and CaMV 35S terminator sequence from plasmid pBGgHg. Intermediate plasmid pYH2873 was made by digesting pCAMBIA1300 with EcoR I and Hind III and inserting the promoter of gpd,EGFP gene and CaMV 35S termi
7、nator sequence from pYH2555. Then pYH2873 was digested by Hind III and ligated to the trp3iar gene which was excited from plasmid pDB06. The plasmid pYH2873 was digested by EcoR I and Hind III,and electrophoresis of the digested products showed two fragments:1.3 bp fragment and 9 kb fragment. The ex
8、pression vector pSAGF was digested by Hind III,and electrophoresis of the digested products showed two fragments:4 kb fragment and 10 kb fragment. Sequencing analysis showed that the recombinant plasmid was correct. Thus the pSAGF,a binary expression vector of V . volvacea,was constructed successful
9、ly. Key words: Volvariella volvacea; EGFP gene; trp3iargene; expression vector 草菇是一种原产于热带及亚热带高温多雨地区的腐生性真菌, 富含多种人体必需的氨基酸, 是一类 营养价值及经济价值较高、 拥有广阔发展前景的食用菌 1。然而由于草菇是初级同宗结合真菌, 生活史 复杂, 且菌丝间无锁状联合, 杂种选择缺乏遗传标记, 给草菇的杂交育种带来了很大的困难。基因工程 技术的发展使得这一难题的解决有了新的途径。绿色荧光蛋白 (Green Fluoresent Protein, GFP) 基因是新 近发现的一种报告基因,
10、从维多利亚生物发光水母中分离出来, 受蓝色光的激发可产生绿色荧光 2。增 强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 是在 GFP 的基础上, 第 64 位氨基 Phe 被替换成 Leu, 第 65 位氨基 Ser 被替换 成 Thr, 在保留 GFP 原有特点的基础上, 其荧光强度为 GFP 的 4 35 倍 3。trp3iar基因是第一个分离自担 子菌的阳性标记基因。由于这个基因来自于担子菌本身, 对食用菌来说属于近同源基因转化, 不易甲基 化, 更易于表达, 因此在食用菌的转化上很有应用前景 4, 5。本文报道了以 EGFP 基因为报告基因, trp3iar为筛选基因的草菇双元表达载体的构建, 成功
11、构建的载体可用来进行草菇转化试验。 1材料和方法 1.1质粒与菌株 质粒 pBGgHg 由美国宾夕法尼亚州州立大学 Peter 教授馈赠, 质粒 pDB06 由英国牛津大学 Casselton 教授馈赠, 转化受体菌 E.coli DH5, 质粒 pBSK II, 质粒 pCAMBIA1300 由上海农科院生物中心保存。 1.2酶及试剂 限制性内切酶 Cla I, EcoR I, Hind III 购自 Biolabs 公司, T4DNA 连接酶购自美国 Promega 公司, 凝胶 DNA 提取 kit 购自杭州维洁特公司, 实验室所用试剂均为进口或国产分析纯试剂。 1.3EGFP 基因的重
12、新克隆 质粒 pBGgHg 用限制性内切酶 EcoR I, Hind III 进行双酶切反应。反应体系为: pBGgHg(1.2g/ L) 15L, 10 Buffer M 5.0L,EcoR I 0.5L, Hind III 0.5L, 无菌 ddH2O 29L, 总体积 50L, 37 水浴酶 解 4 h。以 1%琼脂糖凝胶电泳分离酶解产物, 目的片断采用凝胶 DNA 提取 kit 回收, 步骤按说明书进 行。酶切回收产物与 pBSK II 载体在 T4DNA 连接酶的作用下进行连接。反应体系为: 片断 9.0L (55 ng/L) , 10 T4DNA 连接酶 Buffer 3.0L,
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